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第一部分lncRNA PVT1促进胰腺癌发展及糖代谢重构目的:探讨lncRNA PVT1在胰腺癌组织中的表达情况,并分析其表达与临床病理特征及生存预后的相关性;探讨lncRNA PVT1对胰腺癌细胞转移、转移及糖代谢重构的影响。方法:在湖北省肿瘤医院收集2017年12月到2018年12月经病理证实的胰腺导管腺癌30例患者,利用胰腺癌组织及癌旁组织标本,实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)分析PVT1在胰腺癌组织的表达;结合临床随访,统计分析上述分子指标与胰腺腺癌临床病理特征和预后的相关性;q RT-PCR分析PVT1在人胰腺癌细胞系HPAC、DANG、BXPC3、PANC1、ASPC-1及人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7(H6C7)表达的不同;利用q RT-PCR检测三个si RNA-PVT1的敲减效率;MTT实验,克隆形成实验,划痕实验,transwell实验分析胰腺癌细胞增殖及迁移能力的变化;下调lncRNA PVT1抑制胰腺癌细胞的糖酵解并且减少HIF-1α及糖酵解关键酶的表达;敲减lncRNA PVT1后,用吸光度法测定,并计算葡萄糖摄取量、乳酸分泌量及细胞内ATP含量;蛋白免疫印记(Western Blot,WB)检测HIF-1α及糖酵解关键酶(LDHA、GLUT1、HK2)表达水平。结果:结果显示相比癌旁组织,lncRNA PVT1在胰腺癌组织中高表达,PVT1的表达与胰腺癌患者预后差成正相关,与淋巴结转移成正相关;与人正常胰腺导管上皮细胞相比,lncRNA PVT1在胰腺癌细胞系中高表达,其中HPAC的表达最高;下调PVT1后,HPAC细胞增殖能力下降,划痕实验及transwell实验检测转染后的细胞转移能力下降,吸光度值法检测葡萄糖摄取量、乳酸分泌量及细胞内ATP含量下降,WB检测HIF-1α及糖酵解关键酶(LDHA、GLUT1、HK2)表达水平下降。结论:lncRNA PVT1在胰腺癌组织中高表达,并与胰腺癌患者差预后差成正相关,与淋巴结转移成正相关。lncRNA PVT1可以促进胰腺癌细胞增殖、转移及糖代谢重构。第二部分lncRNA PVT1作为ce RNA募集下调miR-519d-3p来调节HIF-1α的分子机制目的:探讨lncRNA PVT1募集下调miR-519d-3p及miR-519d-3p在转录后水平下调HIF-1αm RNA分子机制,验证lncRNA PVT1通过miR-519d-3p调控HIF-1α的分子机制,从理论机制上解释PVT1的生物学意义。方法:首先,生物信息学分析(microrna.org)预测lncRNA PVT1与miR-519d-3p的结合位点;过表达PVT1或敲减miR-519d-3p,q RT-PCR检测miR-519d-3p及PVT1的表达水平,以证明两者表达呈负相关;构建pmir GLO-PVT1-wt质粒,利用基因定点突变技术构建pmir GLO-PVT1-mut质粒,使用双荧光素酶报告系统检测荧光强度,验证miR-519d-3p与PVT1结合的位点;RNA免疫沉淀反应(RNA immunoprecipitation,RIP)实验验证PVT1和miR-519d-3p可以结合;RNA pull down实验检测PVT1可以富集miR-519d-3p;利用胰腺癌组织标本,q RT-PCR计算PVT1和miR-519d-3p的表达,统计学它们之间的相关性;Targetscan分析HIF-1α和miR-519d-3p结合序列;WB检测HIF-1α蛋白表达量,q RT-PCR检测HIF-1αm RNA表达量,验证胰腺癌细胞内miR-519d-3p与HIF-1α表达相关性;构建HIF-1α3’-非编码区(Untranslated Regions,UTR)质粒,利用基因定点突变技术构建其突变质粒,使用双荧光素酶报告系统检测HIF-1α3’-UTR的荧光强度,验证miR-519d-3p靶基因为HIF-1α;利用胰腺癌组织标本,q RT-PCR检测PVT1及HIF-1α的含量,分析miR-519d-3p与HIF-1αm RNA之间的相关性。结果:生物信息学分析预测lncRNA PVT1与miR-519d-3p的结合位点,q RT-PCR检测胰腺癌细胞lncRNA PVT1与miR-519d-3p表达的负相关性,胰腺组织内两者的表达也为负相关性;双荧光素酶报告系统、RIP实验及RNA pull down实验表明PVT1可以与miR-519d-3p直接结合;以上表明lncRNA PVT1与miR-519d-3p的表达呈负相关,并可以募集结合并下调miR-519d-3p水平;Targetscan预测HIF-1α为miR-519d-3p结合的靶基因。q RT-PCR及WB检测miR-519d-3p与HIF-1α(m RNA及蛋白)表达为负相关性,胰腺组织内两者的表达也为负相关性;双荧光素酶报告系统检测验证miR-519d-3p可以与HIF-1α的3’-UTR结合。结论:lncRNA PVT1与miR-519d-3p的表达呈负相关,并可以募集结合并下调miR-519d-3p;miR-519d-3p可以与HIF-1α的3’-UTR结合,并在转录后水平降低HIF-1αm RNA的表达。第三部分lncRNA PVT1-miR-519d-3p-HIF-1α通路在胰腺癌发展及糖代谢重构的调节作用目的:探讨并阐述此lncRNA PVT1-miR-519d-3p-HIF-1α通路在胰腺癌增殖、侵袭及糖代谢重构的调节作用。方法:敲减lncRNA PVT1与敲减miR-519d-3p共转染,吸光度值法检测共转染后葡萄糖、乳酸及ATP含量变化,并计算葡萄糖摄取量、乳酸分泌量及细胞内ATP含量;MTT实验,克隆形成实验,划痕实验,transwell实验分析胰腺癌细胞增殖及迁移能力的变化;WB检测HIF-1α及糖酵解关键酶(LDHA、GLUT1、HK2)表达水平;构建稳转sh RNA-PVT1及阴性对照的HPAC细胞的皮下异种移植瘤模型,检测肿瘤大小、肿瘤体积及肿瘤质量,q RT-PCR检测miR-519d-3p表达,IHC检测HIF-1α蛋白表达。结果:胰腺癌细胞中,划痕实验及transwell实验验证转移能力,葡萄糖摄取量、乳酸分泌量、细胞内ATP含量及糖酵解关键酶蛋白表达水平验证糖代谢重构的改变,MTT实验、克隆形成实验验证增殖能力,敲减lncRNA PVT1后,可见增殖、转移及糖酵解水平明显下降,利用miR-519d-3p质粒挽救后,其增殖、转移及糖酵解能力后增强。体内实验可见,敲减PVT1后可以抑制小鼠体内肿瘤的生长,增加小鼠体内miR-519d-3p的表达水平,降低小鼠瘤内HIF-1α的蛋白表达水平。结论:在胰腺癌细胞及小鼠体内,lncRNA PVT1-miR-519d-3p-HIF-1α通路调节其增殖,侵袭及糖代谢重构。