【摘 要】
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血液疾病是一直以来困扰人们最大的难题之一,目前虽然通过造血干细胞的移植可以治疗血液疾病,但是一直以来受到供体不足的困扰。本研究目的是建立小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干/祖细胞体外分化模型,将小鼠的胚胎干细胞体外诱导分化成造血干细胞。体外分化主流有两种系统,拟胚体分化和共培养分化,用体外分化体系可以有助于了解早期发育,有助于研究基因的功能,为造血干细胞新来源提供一个可行的方向。本论文的研究主要分为以
【基金项目】
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国家自然基金（31522031,31571526）；
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血液疾病是一直以来困扰人们最大的难题之一,目前虽然通过造血干细胞的移植可以治疗血液疾病,但是一直以来受到供体不足的困扰。本研究目的是建立小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干/祖细胞体外分化模型,将小鼠的胚胎干细胞体外诱导分化成造血干细胞。体外分化主流有两种系统,拟胚体分化和共培养分化,用体外分化体系可以有助于了解早期发育,有助于研究基因的功能,为造血干细胞新来源提供一个可行的方向。本论文的研究主要分为以下三部分内容:1.小鼠胚胎干细胞的培养和鉴定将获得的小鼠胚胎干细胞做生长曲线,计算出细胞的倍增时间,以及细胞生长过程中的指数增长期.接着对胚胎干细胞进行全能性检测,通过碱性磷酸酶染色,多能干性基因表达测定,随机分化实验和畸胎瘤形成实验来验证所获得的胚胎干细胞是具有全能性的,能够发育成三胚层（内胚层,中胚层和外胚层）。2.拟胚体的形成和体外造血分化我们用低粘附的圆底九十六孔板在体外用小鼠胚胎干细胞形成大小固定的拟胚体,在第1到第2天加入BMP4诱导分化到中胚层（Mesoderm）,在第三天加入Activin A和bFGF诱导分化到成血管细胞（Hemangioblast）,第4-6天加入VEGF和IL-6将成血管细胞诱导分化成内皮细胞,然后经由内皮到造血转化产生造血干/祖细胞。在诱导分化的过程中用流式细胞术检测造血表面标志物的表达水平,用实时定量PCR的方法检测各阶段相关基因的表达水平。流式结果显示成血管细胞（Flk-1+）第二天出现并在第三天快速增加,内皮细胞（Flk-1+CD31+）第三天开始出现并持续增加,造血细胞（CD41+）第四天出现并在持续增加,结果证明有内皮细胞和造血细胞的标志物出现,荧光定量PCR结果与流式相符。结果显示通过拟胚体分化的方法可以将胚胎干细胞诱导往血液方向分化。3.用共培养的方法体外造血分化我们将小鼠的胚胎干细胞与OP9细胞共培养。实验过程中,将OP9细胞接种到培养板上,待到细胞生长到覆盖率为100%的时候,然后将胚胎干细胞接种在OP9细胞上面,OP9细胞会分泌一些物质诱导胚胎干细胞向造血方向分化。随后我们用流式细胞术的方法检测各阶段表面标志物的表达水平。结果显示,在第3天的时候Flk-1出现表达,并持续增加,在第8天的时候检测到造血表面标志物CD41的表达,并且在显微镜下可以观测到内皮造血转换的过程,结果显示通过共培养的方法可以将胚胎干细胞诱导往血液方向进行分化。通过以上三部分的实验可以得出以下结论:首先所获得的的胚胎干细胞是具有全能性的,能分化成三个胚层;其次通过拟胚体和共培养的方法可以将胚胎干细胞诱导成血细胞;最后在共培养系统上我们可以观测到内皮造血转换过程的发生。
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