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目的本实验的目的是研究CCRL2在胶质瘤中的作用,包括其在肿瘤发生、发展、肿瘤转移中的作用。从中获得的结论将会对趋化因子受体在肿瘤中的作用研究提出新的视点。方法(一)RT-PCR方法收集12例胶质瘤组织样本,设计合成CCRL2特异性引物,按照操作说明,将12例胶质瘤患者肿瘤组织的总RNA用TRIZOL试剂(invitrogen Corp)法分离出来,纯化的RNA通过SuperScriptTM二代逆转录酶(invitrogen Corp)反转成c DNA。CCRL2m RNA的表达通过CCRL2特异性引物进行PCR检测。设计合成CCRL2特异性引物,培养胶质瘤细胞U87、U373,运用半定量RT-PCR方法检测胶质瘤细胞CCRL2的表达。(二)MTT检测培养胶质瘤细胞U87、U373,将7500个胶质瘤细胞种植在96孔板上,最初的细胞密度是7500个/孔。在种植后的1、2、3、4或5天后,培养基换成100μl新鲜无血清培养基。用PBS液溶解MTT,10μl灭菌过滤后的MTT原液(5mg/mL),加到每一个细胞孔中,达到约0.5mg/mL的终浓度。孵育3小时后,未反应的染料连同培养基被清除。用100μl DMSO溶解结晶,将细胞培养板盖上盖子,室温下置于暗处2-4小时或者放置过夜。之后用全自动定量绘图酶标仪(Thermo Electron Corporation Multiskan Ex, USA)在波长570nm处检测各孔吸光度,以波长690nm作为参考。相对细胞活力通过以下公式计算：细胞活力(%)=实验组570nm吸光度/对照组570nm吸光度×100%(三)划痕实验运用划痕实验检测CCRL2对于细胞迁移的影响。在划痕实验中,拟转染CCRL2或者CCRL2-siRNA的U373胶质瘤细胞种植于24孔板中,当细胞密度达到70%左右时,用CCRL2或CCRL-siRNA转染细胞,24小时后,用塑料枪头在细胞层上划出一条直线,用新鲜培养基清洗,去除贴壁疏松的细胞。在划痕产生后即刻(0小时)以及之后的10、24小时,细胞相差图(10×)用倒置显微镜(Olympus IX50)拍照,以检测伤痕愈合过程进展。伤痕距离在图像上测量,设置0小时为100%,计算出伤痕总距离的平均百分比值。每一个实验条件在同一个时间点,取3条伤痕的3个随机测量值为结果,每一次实验重复4次。(四)细胞侵袭性实验为了检测CCRL2过表达对胶质瘤细胞侵袭性的影响,将U87、U373细胞转染pcDNA-CCRL2或对照质粒pcDNA-GFP。24小时后,细胞悬浮于含1%FBS的培养基中。BioCoatTM MatrigelTM(基质胶)包被小室,相同的细胞数量(约3×104个细胞)种植于配套的24孔板中,含10%FBS的MEM培养基加入到小室下室作为趋化剂。将小室放入培养箱,在37℃,5%C02条件下孵育22小时。用棉签在小室上室将未能穿透的细胞擦去,贴于小室下室的细胞分别用100%甲醇和1%甲苯胺蓝固定染色。穿过的细胞在放大倍数40—200×的显微镜下拍照,在膜的不同区域计数细胞。对于每一个小室而言,要计数3个随机挑选区域的细胞数。穿过的细胞总数通过对选择区穿过细胞数的平均值来进行估计。细胞迁移的程度以穿过的细胞占实验初种植于上室细胞的百分比来表示。本实验重复3次,每次3个复孔。(五)统计学分析所有的实验均重复3次,3个复孔。数据以均值±标准差表示,用t检验法,以p值<0.05看作差异有统计学意义。结果(一)CCRL2在胶质瘤组织和细胞中的表达以看家基因GAPDH作为内参,发现CCRL2表达于胶质瘤组织,其表达量明显高于正常组织。发现胶质瘤细胞CCRL2表达升高。(二)过表达或敲低CCRL2对胶质瘤细胞增生的影响在转染后1、2、3或4天,转染pcDNA-CCRL2的U87、U373细胞相对于对照组细胞(转染pcDNA-GFP)显示了相似的生长速率。U87细胞用CCRL2-si RNA转染,CCRL2-si RNA-NC作为对照,在转染后1、2、3或4天,转染CCRL2-si RNA的U87细胞相对于对照组细胞(转染CCRL2-si RNA-NC)显示了相似的生长速率。(三)CCRL2促进胶质瘤细胞的迁移转染pcDNA-CCRL2的U373细胞迁移率快于转染pcDNA-GFP或者空白转染的U373细胞。(四)CCRL2促进胶质瘤细胞的侵袭性transwell侵袭实验中,将U87、U373细胞转染pcDNA-CCRL2或对照质粒pcDNA-GFP,并种植于与小室配套的24孔板中,孵育22小时后,每个视野随机选择5个区域量化穿透到达小室下室的细胞数。转染pcDNA-CCRL2的胶质瘤细胞穿透率明显高于对照组。结论(一)CCRL2表达于胶质瘤组织及培养的胶质瘤细胞,其表达量明显高于正常组织。(二)CCRL2对胶质瘤细胞增生的影响在本实验中不明显。可能需要进一步的实验进行分析。(三)CCRL2促进胶质瘤细胞的迁移。(四)CCRL2促进胶质瘤细胞的侵袭性。