煤炭生物转化是一种清洁的煤炭利用技术,具有反应条件温和,能耗低,环境友好的优点。从研究至今的四十多年里,煤炭生物转化技术得到了蓬勃的发展,但是却仍然存在一些问题,其中最为关键的是煤炭生物转化效率低。本文尝试利用基因工程技术对真菌进行改造以提高转化效率,为煤炭生物转化的工程应用提供技术参考。主要研究结果如下:(1)研究对象为实验室保存的一株煤炭降解真菌AH,ITS基因鉴定该菌为哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。利用NCBI网站已公布的哈茨木霉菌基因组信息进行比对,之后利用多个分析工具筛选得到四个适合过表达的基因,扩增其完整基因序列。扩增得到的基因与已公布的基因只有少数几个碱基差异,并且都能翻译成完整的蛋白质,能够用于基因的过表达。(2)同时为了了解AH菌的褐煤降解特性,进行了固体平板培养和液体发酵实验。结果表明AH菌液化褐煤的能力与褐煤的氧化程度有关,氧化程度越高,越容易被液化;液体发酵实验发现加入硝化煤后能够使AH菌菌丝重量增加近60%,并且AH菌能够降解硝化煤产生大量的腐殖酸,同时使硝化煤的失重率达到60%,说明AH菌在培养的过程中不仅能够分泌一些胞外物质溶解煤粉,还能够分泌胞外酶降解煤粉颗粒,而且降解后的小分子物质能够促进菌丝的生长。转录组实验以及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的实验结果表明煤粉的加入能够促进AH菌中木质素降解酶基因的表达,红外光谱分析表明AH菌降解褐煤时对于含有羰基官能团的化合物和带侧链的芳香族化合物具有较强的降解能力。(3)改造已有的pkd7-RFP质粒以获得pkd7-HYG质粒,使其更适用于AH菌的转化与转化子的筛选,将目的基因与pkd7-HYG质粒连接获得重组质粒pkd7-HYG-340、pkd7-HYG-348、pkd7-HYG-463、pkd7-HYG-568。将各质粒导入农杆菌AGL-1后,利用改良后的ATMT(农杆菌介导转化)方法,进行AH菌的转化实验,得到过表达菌株:AH-340转化子8株,AH-348转化子8株,AH-463转化子8株、AH-568转化子12株。(4)利用PCR检测各转化子的遗传稳定性,挑选基因表达量高、胞外蛋白含量高的转化子菌株进行褐煤降解实验。结果显示:过表达菌株降解褐煤时菌丝重量相较于不加煤空白组都出现了不同程度的上升,其中以AH-340、AH-463、AH-568菌株的菌丝重量上升幅度最大,分别达到了约40%、25%、10%,原始AH菌株几乎无变化;发酵上清液酸沉淀结果显示,AH-340、AH-348、AH-463、AH-568过表达菌株加煤后的沉淀质量显著高于原始AH菌。过表达AH菌株降解褐煤时能够产生比原始AH菌株更多的腐殖酸类物质,并且菌丝重量增长率也明显提高,说明对原始AH菌株的基因进行过表达的确能够在一定程度上增强AH菌降解褐煤的能力。本论文共有33张图,12张表格,95篇参考文献。