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研究背景TNBC(Triple negative breast cancer,三阴性乳腺癌)约占乳腺癌的15-20%,是一类缺乏雌、孕激素受体及HER-2(Human epidermal growth factor receptor-2,人表皮生长因子受体-2)表达的乳腺癌。由于缺乏传统内分泌及靶向治疗靶点,目前TNBC全身治疗以化学治疗为主。与其他类型乳腺癌相比,TNBC复发、远处转移风险更高,预后也更差,寻找能改善TNBC疗效及预后的治疗方案尤为重要。约有10-32%的TNBC表达AR(Androgen receptor,雄激素受体),许多临床试验对AR拮抗剂在TNBC治疗有效性方面进行了探索,认为AR可作为TNBC治疗靶点。顺铂是一类作用于DNA的细胞毒性药物,不少研究显示在新辅助及辅助治疗中应用顺铂可改善TNBC预后。AR拮抗剂与顺铂联合应用于TNBC少见国内外相关文献报道,两者联合使用疗效有待进一步研究。研究目的探讨TNBC中AR表达情况,分析其表达与临床、病理特征的关系及临床意义;研究顺铂序贯比卡鲁胺对AR+TNBC细胞增殖及凋亡的影响。研究方法1.收集青岛市市立医院2016.1-2018.12乳腺癌术后经病理确诊的TNBC病例,共101例。通过免疫组织化学染色法检测AR表达情况,回顾性分析AR表达与临床、病理特征(年龄、月经状况、肿瘤大小、淋巴结转移情况、组织学分级、TNM分期及Ki-67、p53、EGFR、CK5/6表达情况)的关系及临床意义,应用SPSS 22.0进行χ~2检验,P<0.05为差异有统计学意义。2.选取三种TNBC细胞株,分别为MDA-MB-453、BT-549以及MDA-MB-231,通过qPCR法检测三种细胞系AR mRNA相对表达量。3.应用CCK8(Cell counting kit-8,细胞计数试剂盒-8)法,通过酶标仪测定450nm波长处每孔吸光度,分别计算顺铂、比卡鲁胺不同作用时间(24h、48h)的IC50(50%inhibition concentrition,半数抑制浓度)。4.应用CCK8法检测对照组、顺铂单药组(1umol/L;48h)、比卡鲁胺单药组(2.5umol/L、25umol/L;48h)及顺铂(1umol/L;24h)序贯比卡鲁胺(2.5umol/L、25umol/L;24h)组药物作用48h对细胞增殖的影响,酶标仪测定450nm波长处每孔吸光度,计算细胞增殖率。采用周氏中效原理,应用CompuSyn软件计算CI(Combination index,联合指数),评估顺铂序贯比卡鲁胺对细胞增殖的作用效果,CI>1为拮抗作用,CI=1为相加作用,CI<1为协同作用。5.应用流式细胞技术Annexin V-FITC/PI双染法检测对照组、顺铂单药组(1umol/L;48h)、比卡鲁胺单药组(2.5umol/L、25umol/L;48h)及顺铂(1umol/L;24h)序贯比卡鲁胺(2.5umol/L、25umol/L;24h)组药物作用48h对MDA-MB-453细胞凋亡的影响,总凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。研究结果1.免疫组织化学染色结果显示,101例TNBC中有29例为AR表达阳性(28.71%)。2.AR表达在不同AJCC TNM分期中存在显著统计学差异(χ~2=15.950~a,P=0.001),其中III期患者AR阳性率最高,为71.43%(10/14例),0期、Ⅰ期及Ⅱ期患者AR阳性率分别为33.33%(1/3例)、14.7%(5/34例)及26.00%(13/50例)。伴有淋巴结转移者AR阳性率为54.05%(20/37例),明显高于淋巴结阴性者(14.06%;χ~2=18.319~a,P=0.000)。AR表达在不同Ki-67表达水平中存在统计学差异(χ~2=9.461~a,P=0.024),Ki-67低、中表达者AR阳性率较高,分别为46.15%(6/13例)和44.44%(12/27例),而Ki-67阴性及高表达者AR阳性率分别为0%(0/5例)及19.64%(11/56例)。AR表达与患者年龄(χ~2=2.119~a,P=0.146)、月经状况(χ~2=1.002~a,P=0.317)、肿瘤大小(χ~2=1.055~a,P=0.590)、组织学分级(χ~2=5.380~a,P=0.068)及EGFR(χ~2=2.375~a,P=0.123)、CK5/6(χ~2=3.092~a,P=0.079)、p53(χ~2=0.845~a,P=0.358)表达无关。3.以qPCR结果所测Ct值,计算2~^-△△Ct表示mRNA相对表达量,MDA-MB-453、BT-549及MDA-MB-231细胞AR mRNA相对表达量分别为700.61±5.27、13.92±0.55和1.01±0.15,表明三种TNBC细胞中,AR mRNA表达从高到低依次为MDA-MB-453>BT549>MDA-MB-231。该结果与Speers C、Barton VN、Liu CY、Wang Y等的研究结果相符。4.MDA-MB-453、BT-549、MDA-MB-231细胞顺铂(24h)IC50分别为53.19±2.00umol/L、11.72±1.73umol/L及40.91±5.28umol/L;顺铂处理48h,三种细胞IC50均较前降低(P<0.01),分别为6.63±0.05umol/L、3.19±0.96umol/L、18.24±1.27umol/L。MDA-MB-453、BT-549、MDA-MB-231细胞比卡鲁胺(24h)IC50分别为169.70±23.96 umol/L、406.17±19.37 umol/L、693.07±11.10 umol/L;比卡鲁胺作用48h,MDA-MB-453及BT-549细胞IC50较前下降明显(P<0.05),分别为72.92±4.01umo/L和127.04±3.56umol/L,MDA-MB-231细胞IC50(659.04±23.03umol/L)与作用24h相比,下降不显著(P>0.05)。5.细胞增殖实验结果显示,在MDA-MB-453和BT-549细胞中,顺铂序贯比卡鲁胺组与单药组及对照组相比,对细胞增殖抑制作用增强(P<0.05)。MDA-MB-453细胞顺铂(1umol/L)序贯比卡鲁胺(2.5umol/L、25umol/L)组CI值分别为0.34±0.01和0.79±0.03,BT-549细胞CI值分别为0.16±0.02和0.56±0.01。两种细胞CI值均小于1,说明顺铂序贯比卡鲁胺对MDA-MB-453及BT549细胞增殖起协同抑制作用。MDA-MB-231细胞各处理组间细胞增殖率无显著差异(P>0.05)。6.细胞凋亡实验结果显示,AR高表达MDA-MB-453细胞顺铂(1umol/L)序贯比卡鲁胺(2.5umol/L、25umol/L)组凋亡率分别为23.73±0.25%和26.67±0.42%,单药顺铂1umol/L、比卡鲁胺2.5umol/L及比卡鲁胺25umol/L组凋亡率分别为18.17±0.31%、9.30±0.26%及16.97±0.15%,对照组凋亡率为5.40±0.56%,说明顺铂序贯比卡鲁胺可明显诱导MDA-MB-453细胞凋亡(P<0.05)。研究结论1.AR在TNBC中表达率为28.71%(29/101例),其表达与TNM分期、淋巴结转移情况及Ki67表达水平密切相关,其中III期、伴有淋巴结转移及Ki-67低、中表达者AR表达率高。2.顺铂序贯比卡鲁胺对MDA-MB-453及BT-549细胞增殖起协同抑制作用;在MDA-MB-453细胞中顺铂序贯比卡鲁胺显著诱导细胞凋亡。