目的：视网膜色素上皮细胞(retinal pigmented epithelium cells，RPECs)是位于脉络膜和神经视网膜间的单层色素上皮细胞，其构成了血-视网膜外屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)。此屏障功能是维持视网膜视觉生理功能状态的重要的基础。临床上许多眼病如渗出性老年黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变等均与视网膜外屏障的破坏有关。因此本课题目的是探索人胚眼发育过程中血-视网膜外屏障是如何形成的，研究构成此屏障的紧密连接(tightjunction，TJ)相关基因的差异表达。建立体外细胞培养模型来模拟体内RPE发育成熟过程，研究血-视网膜外屏障是如何构建的以及功能情况。并对体外CFSE标记的乳兔眼RPECs进行视网膜下移植，观察标记的供体细胞在视网膜下的分布、移行和与受体RPE的整合及屏障重建情况。　　 方法：选取不同发育时期(13和16周)引产的人胚胎及角膜移植后的成人眼，解剖显微镜下仔细分离RPECs层，提取总RNA。采用microarray技术对不同发育时期的紧密连接相关基因表达进行研究，并采用real-time PCR进行验证其差异表达基因的变化情况。分别将16周人胚眼RPECs及乳兔RPECs培养于Transwell微孔滤膜上，使细胞形成类似于体内的单层细胞。采用不同浓度的血清培养液和无血清细胞培养液，并通过单层上皮电阻(Trans-epithelialElectrical Resistance，TER)的测定来评价所培养细胞的屏障功能。待TER形成稳定的平台后，用定量real-time PCR技术对构成血视网膜外屏障的紧密连接相关基因进行mRNA表达水平研究，利用Western Blot进行紧密连接跨膜蛋白Occludin、Claudin和骨架蛋白的表达研究，用荧光免疫细胞化学技术结合电镜、共聚焦显微镜来观察RPECs间紧密连接蛋白的表达和定位。完成对乳兔RPECs培养并采用活体染料CFDA-SE标记，将标记后的乳兔RPECs进行单通道视网膜下，术后采用激光扫描检眼镜、光学相干断层扫描、眼底荧光血管造影、吲哚氰绿血管造影、彩色眼底照相等活体影像学技术手段，并结合免疫组织化学、免疫细胞化学及光、电镜技术来追踪观察标记的供体色素上皮细胞移植到受体后的一系列变化情况。　　 结果：不同发育期胚胎眼(13周、16周)与成人眼RPE的相关基因的差异表达结果表明RPE紧密连接主导基因Claudin19的表达逐渐下降，13周到成人眼下调2倍以上。体外将16周胚胎眼RPECs培养到Transwell的滤膜上，形成极性的单层RPECs，4-6周重新构建了血视网膜外屏障，其所形成的外屏障在血清或无血清培养液中TER分别达到1000Ω×cm2和400Ω×cm2左右，且可稳定达6个月和3个月。TER随培养液中血清浓度的下降而降低，特别是无血清培养基其TER水平达到或接近体内水平，所以无血清培养液更真实的反映体内的情况。但将血清加回不同的培养室中，只有加到类似于体内视网膜下腔的顶室培养液中，TER又增高。屏障的离子选择性主要是对钾离子阻力变小，通透性增加；而对钠离子选择性阻断最强。此种离子的选择性有利于保持视网膜下腔的高钠状态。我们发现在人类RPECs，无论是体内胚眼还是体外培养的，均是以Claudin19绝对高表达的上皮组织，Claudin3表达较Claudin19减少25倍，而其它Claudin如1、2、10等较Claudin19表达减少3000倍。体外培养的RPECs多数Claudin和Occludin的表达接近体内水平。可见血清培养液轻微增加Claudin19、Claudin3、Claudin1和Occludin的蛋白表达，从而增大TER，增强屏障功能；相反无血清培养基或血清只加到底房培养液中则降低上述蛋白的表达，而却增加渗漏蛋白Claudin2的表达。siRNA沉默Claudin19后，降低Claudin19在mRNA和蛋白水平的表达，TER明显的降低，甚至RPE屏障功能丧失。免疫荧光细胞化学技术结合激光共聚焦显微镜技术检测到Claudin19、Claudin3和Occludin等蛋白与ZO-1蛋白共同定位于细胞间的紧密连接。Claudin1，2等只表达于少数或个别的细胞。培养出纯化的乳兔RPECs，并在体外完成单层培养，建立体外血视网膜外屏障，TER值最高可达到400-450Ω×cm2。将CFSE标记的供体乳兔RPECs移植到受体兔眼视网膜下的，染色的供体细胞可在体内追踪到绿色荧光至6个月。细胞移植术后观察显示移植区界限清晰；cSLO和FFA及OCT对受体眼活体组织检查，发现早期有移植物堆积，随时间的推移逐渐变平，在移植后2月的观察发现标记供体细胞已与受体RPE整合成单层。受体眼重新构建的血-视网膜外屏障未检测到渗漏和破坏。视网膜组织切片染色可见单层RPE，透射电镜显示移植区色素上皮细胞间紧密连接存在。在移植术后长达6个月的时间内，活体检查及免疫细胞化学和组织化学检查也没有发现免疫排斥的迹象。　　 结论:16周人胚眼RPECs体外培养4-6周重新构建了血-视网膜外屏障，目前是研究RPE间屏障功能与调控最理想的细胞模型之一。人胚眼RPE，无论是体内组织还是体外培养的，均是以Claudin19显著高表达、Claudin3和Occludin次要表达的上皮组织，这三种蛋白与屏障功能密切相关。血清于顶室培养液中升高TER，加强屏障功能，降低屏障的通透性。这可能反映了临床上视网膜下腔出血时，RPE防止水肿和出血向周围扩散的防御性反应机制。CFSE标记的供体乳兔RPECs在移植后2月时可见供体细胞已与受体细胞RPE整合成单层，并可在受体内追踪到绿色荧光至6个月。电镜可检测到移植区色素上皮细胞间紧密连接形成，血-视网膜外屏障未检测到渗漏和破坏及没有发现免疫排斥的迹象。