论文部分内容阅读
原发性肝癌（主要为肝细胞肝癌,以下简称肝癌）是世界上常见的恶性肿瘤之一,据报道肝癌每年发病率位居全球所有恶性肿瘤发病率的第6位,而病死率高居第3位,主要发生在在东南亚和撒哈拉南部非洲国家;近年来,欧美国家的肝癌发病率有增高的趋势。中国是肝癌高发的国家,每年新发病例数约占全球新发病例数的55%,肝癌病死率位居国内所有恶性肿瘤病死率在男性中为第2位,女性中为第3位。外科手术切除是根治性治疗肝癌的主要方法,但也存在术后复发率较高这样的风险,且许多患者明确诊断时已处于肝癌晚期,具有手术机会的患者只占30%左右。化疗对肝癌常无效。因此对于多数肝癌患者,寻找有效、低毒并且针对肝癌特异性高的新型药物仍是临床亟待解决的问题。各国学者先后从动物脾脏中提取了具有抗肿瘤和激活免疫系统活性的多肽,脾脏为机体中最大的免疫器官,其中含有大量的网状内皮细胞、巨噬细胞及树突状细胞,这些细胞及其分泌的分子在传递肿瘤信息及杀伤肿瘤细胞过程中发挥着重要的作用,同时脾脏还含有大量的淋巴细胞,是机体对肿瘤进行免疫监视的重要屏障。本研究所应用的酪丝缬肽（tyroservatide,YSV）亦是从脾脏提取的一种小分子多肽,由3个氨基酸组成,化学结构组成为-.酪氨酸-L-丝氨酸-L-缬氨酸,我们观察酪丝缬肽对人肝癌细胞SMMC-7721及其裸鼠模型移植瘤的增殖抑制作用,并研究其作用机制。我们发现酪丝缬肽在体内体外均能显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,其机制主要在于通过基因及蛋白水平下调促血管生成相关因子VEGF及IL-8的表达。1.YSV能够抑制人肝癌细胞SMMC-7721及其裸鼠移植瘤的增殖分别以不同剂量的YSV在体外作用于人肝癌细胞SMMC-7721,各剂量组分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1.0mg/L、10mg/L、100mg/L,对照组为等体积含10%FBS的RPMI-1640培养液,5%CO2,37℃条件下,药物作用24h、48h、72h后进行MTT检测。YSV作用72h时各浓度对肿瘤细胞的抑制作用最为明显,尤其在剂量10mg/L时,抑制率可以达到68.59%。针对人肝癌SMMC-7721裸鼠模型,我们予以三个不同剂量组（640 ug/kg/d、320 ug/kg/d、160ug/kg/d）,对照组为等体积的生理盐水,从肿瘤种植后第二日经腹腔注射,每日一次,连续给药35d,当给药剂量为160μg/kg/d,320μg/kg/d,640μg/kg/d时,肿瘤抑制率分别为42.62%,60.66%,27.59%。与对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。2.免疫组化法证明YSV能够抑制肿瘤组织新生血管生成为了证实YSV对移植瘤新生血管生成作用的影响,我们选取CD31鼠单克隆抗体进行免疫组化染色,YSV作用剂餐为320μg/kg/d时,肿瘤组织CD31表达较弱,在200倍的视野下,微血管密度的平均值为36±11.6,对照组为114.5±26.5,两组比较有显著的差异（P＜0.05）。3.YSV作用后血管生成相关基因表达差异的研究为了寻求YSV作用后移植瘤血管生成能力变化的机制,我们采用Superarray血管生成相关基因芯片,对对照组及YSV剂量组（320μg/kg/d）肿瘤组织中血管生成相关基因的表达谱进行分析,以上调或下调超过2倍为检测标准。与对照组比较,YSV剂量组肿瘤组织中促血管生成基因血管内皮生长因子（VEGF）及白细胞介素8（IL-8）下调最为明显。针对体外试验,我们同样采用基因芯片法进行验证并得到相同的趋势。4.RT-PCR、荧光定量PCR、western blot及ELISA法验证基因芯片结果针对体外细胞试验,RT-PCR方法显示YSV作用后（10mg/L,100mg/L）肿瘤细胞VEGF及IL-8 mRNA表达减弱。荧光定量PCR检测对照组与YSV剂量组肿瘤组织中VEGF与IL-8 mRNA表达的强弱,结果显示YSV剂量组VEGF（P＜0.05）与IL-8（P＜0.05）mRNA表达减弱。Western blot方法检测肿瘤组织及体外肿瘤细胞中VEGF蛋白表达情况,结果提示YSV作用后,较之对照组VEGF蛋白表达明显下调。ELISA法检测裸鼠血清中VEGF及IL-8等因子的浓度,结果提示YSV剂量组裸鼠血清中VEGF与IL-8等因子含量维持在较低水平,与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果提示YSV对VEGF及IL-8等血管生成因子表达的抑制是其发挥抗肿瘤活性的重要原因。结论1.酪丝缬肽（YSV）能够抑制肿瘤细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤的生长,并能抑制体外培养的肿瘤细胞的增殖。2.YSV通过下调VEGF及IL-8血管生成因子的表达阻断肝癌血管生成进而抑制肿瘤生长。