瘤胃细菌脲酶水解尿素为氨，氨可被微生物吸收利用，所以脲酶在尿素氮循环中发挥关键作用。但是，瘤胃脲酶活性较强，导致尿素分解速度超过了氨的利用速度，降低了尿素氮利用率，而且易引起动物氨中毒。本研究以调控脲酶活性，减缓尿素分解为目标，利用厌氧分离培养、高通量测序、蛋白质表达纯化以及免疫学等方法，从瘤胃中分离产脲酶菌菌株，比较瘤胃壁和瘤胃内容物脲酶基因多样性差异，利用基因工程方法表达幽门螺杆菌脲酶蛋白，并与瘤胃脲酶蛋白进行免疫交叉反应分析，联合体外和体内法研究抗脲酶抗体对瘤胃脲酶活性和尿素分解速度的调控及其机理。为了从瘤胃壁和瘤胃内容物中分离产脲酶菌，利用含尿素的厌氧培养基，进行传代培养，通过qPCR监测脲酶基因的丰度变化，经涂平板和划线分离，挑取单菌落测定脲酶基因和16S rDNA序列。结果从瘤胃壁分离得到2株产脲酶菌，UB1属于Bacillus licheniformis，UB2属于Proteusmirabilis；从瘤胃液中分离得到3株产脲酶菌，UB3属于Ruminococcus albus，UB4属于Succinivibrio dextrinosolvens，UB5属于Treponema bryantii。瘤胃中这5株产脲酶菌的形态特征和脲酶活性各不相同，其中UB3脲酶活性最高。UB1、UB4和UB5三株菌的脲酶基因与数据库相比，只有80%-89%的相似度，表明分离得到了新的脲酶基因。为了分析瘤胃壁和瘤胃内容物脲酶基因多样性，选择脲酶基因简并引物，对PCR产物进行Roche454测序，利用QIIME软件包进行序列质量控制、OTU分型、多样性和聚类分析。结果表明瘤胃脲酶基因以0.03作为OTU分类阈值，发现瘤胃壁上脲酶基因与瘤胃内容物中脲酶基因相比，α多样性无差异，而β多样性则有差异。聚类分析时，瘤胃壁与瘤胃内容物脲酶基因各自聚成簇，表明瘤胃壁上存在着独特的脲酶基因和产脲酶菌群，并且大部分脲酶基因都是新基因。比较发现OTU2为瘤胃壁上独有脲酶基因，而OTU4为瘤胃液中独有脲酶基因。通过qPCR发现瘤胃壁脲酶基因比例显著高于瘤胃内容物。在脲酶基因系统发育树上，大部分瘤胃脲酶与幽门螺杆菌脲酶同源性高。为了大量制备高纯度细菌脲酶蛋白，通过基因工程方法，将幽门螺杆菌脲酶基因克隆到pET表达载体，并转化E.coli BL21(DE3)，利用IPTG诱导表达，通过Ni-NTA柱子纯化脲酶蛋白。免疫大白兔，制备抗脲酶多克隆抗体，并利用抗体亲和ProteinA柱子纯化抗体。结果成功构建脲酶基因表达菌，从中表达纯化得到5mg脲酶蛋白，从大白兔血清中纯化得到效价为1:12800的抗脲酶多克隆抗体，为后续的动物免疫试验提供了抗原蛋白。为了验证幽门螺杆菌脲酶与瘤胃脲酶的免疫交叉反应性质，收集奶牛瘤胃微生物菌体，超声破碎、盐析并透析后，用HiTrap Capto Q离子交换层析柱分离纯化瘤胃脲酶。利用改良的Fishbein凝胶染色法和LC-MS/MS，鉴定瘤胃脲酶蛋白。以抗幽门螺杆菌脲酶多克隆抗体为一抗，通过western-blotting检测两种来源脲酶免疫交叉反应。结果从不含菌体细胞的瘤胃液和瘤胃菌体蛋白液中纯化得到脲酶，酶活力分别达到151.53U/mg和541.90U/mg，纯化倍数分别为10.73和8.95倍，但经染色后只有瘤胃菌体蛋白液脲酶显示活性条带，经质谱鉴定，活性条带含有脲酶肽段。经免疫印迹分析，发现幽门螺杆菌脲酶与瘤胃脲酶具有免疫交叉反应的特性，为利用幽门螺杆菌脲酶抗原免疫调控瘤胃脲酶活性提供了进一步依据。为了在体外检验抗脲酶多克隆抗体的抑制尿素分解效果，在发酵瓶中添加0、0.5和1.0mL抗脲酶多克隆抗体血清，静态培养后检测瘤胃发酵指标，计算尿素降解和氨生成速率，利用DGGE检测细菌群落变化。结果发现添加抗脲酶多克隆抗体，能使尿素降解速率减少70%，氨生成速率减少18%，能显著提高总VFA、乙酸、丙酸和戊酸含量。添加抗体后，DGGE图谱上条带的数量、位置和光密度发生了变化，微生物群落相似度与对照组相比只有51%，细菌多样性减小。添加抗体后，发酵液中产脲酶菌占总菌的比例显著降低，这有可能是产脲酶菌被选择性的抑制，揭示了尿素降解减缓的原因。为了通过免疫方法抑制瘤胃脲酶活性，选择8头奶牛，免疫由幽门螺杆菌脲酶和弗氏佐剂组成的脲酶免疫刺激物，初次免疫后进行3次加强免疫。结果发现免疫脲酶免疫刺激物后，有效激发了奶牛体液免疫应答，提高了血清和唾液中IgG和IgA特异性抗体效价，IgG和IgA效价分别在第4次和第3次免疫后效价达到最高值。免疫后脲酶活性减少了17%，而瘤胃pH、VFA含量、瘤胃干物质和粗蛋白的动态降解率均无显著性变化。瘤胃灌注尿素后，免疫组与对照组相比，第1h时，氨氮浓度减少了36%，第4h后没有显著差异，表明抗体能抑制尿素分解的最初阶段。