术后睡眠障碍（Post-operative sleep disorder,POSD）是指由于手术或麻醉因素导致的睡眠结构和（或）睡眠周期的破坏,表现为入睡困难、睡眠维持困难、睡眠碎片化、多梦以及昼夜节律紊乱等。术后睡眠障碍是围术期常见并发症,其可加剧术后疼痛、延迟胃肠功能恢复、扰乱内分泌、激发负面情绪,严重影响患者预后。如何预防患者术后睡眠障碍,加快患者术后恢复是临床实践中面临的重要问题。生物节律系统在睡眠调控中发挥重要作用,决定睡眠时间和睡眠深度。下丘脑是参与睡眠-觉醒调控的重要脑区,生物节律中枢位于下丘脑视交叉上核（Suprachiasmatic nucleus,SCN）,SCN神经元细胞核中核心时钟因子（CLOCK、BMAL1、PER、CRY）的昼夜振荡在维持机体节律稳定和睡眠结构调控中发挥重要作用。大量临床研究表明POSD具有节律紊乱的特点,提示生物节律系统在POSD中发挥重要作用。目前的研究认识到全身麻醉是节律紊乱的重要诱因,丙泊酚（Propofol）作为临床常用静脉麻醉药,具有诱导迅速、维持稳定、易苏醒和副作用小的特点,在多种手术中广泛应用。临床研究表明,丙泊酚全身麻醉这一单一因素即可诱发患者生物节律紊乱,但丙泊酚全身麻醉所致POSD的睡眠特征,及其通过何种机制影响节律和睡眠尚不清楚,如何有效预防更是亟待解决的问题。褪黑素（Melatonin）是在SCN调控下由松果体分泌的一种胺类激素,其合成和分泌具有显著的昼夜节律性,是生物节律中枢调节机体生物钟的重要信号分子。作为美国睡眠医学会推荐的唯一具有节律调控作用的药物,褪黑素调节睡眠和节律的作用已被广泛验证,预防性使用褪黑素能够显著改善昼夜节律失调引起的睡眠障碍,如时差综合征、睡眠-觉醒节律紊乱和睡眠时相延迟等。褪黑素是否能够作为潜在干预手段应用于术后节律紊乱和睡眠障碍有待进一步研究。因此,本研究拟在全面评价丙泊酚全身麻醉所致睡眠与节律障碍的基础上,进一步研究褪黑素的干预作用,并围绕时钟因子调控和氧化-还原平衡两个方面探索其节律调控作用机制。实验目的本研究通过模拟临床麻醉给药方式考查丙泊酚对睡眠和节律指标的影响,采用无线生理信号遥测系统监测睡眠、体温和活动节律,并对睡眠深度和睡眠结构进行解析,在此基础上研究褪黑素的干预作用,围绕下丘脑核心时钟因子蛋白表达及翻译后修饰过程、内源性褪黑素调控、血清和下丘脑氧化应激指标探讨其干预作用的相关分子机制,为进一步阐明褪黑素的药理作用机制和扩大褪黑素的临床应用提供实验依据,也为揭示全身麻醉所致术后睡眠障碍的病理生理机制做出贡献。实验方法1.丙泊酚对大鼠生物节律的影响（1）丙泊酚麻醉对生物节律的影响:雄性（Sprague-Dawley,SD）大鼠,体重220-240 g,饲养于12 h/12 h光/暗节律环境,光周期开始时间为早08:00,定义为昼夜节律时间0点（Circadian time 0,CT0）。6只SD大鼠进行植入子手术,术后恢复一周。术后第8日CT0采用无线生理信号遥测系统采集24 h睡眠、体温、自发活动信号作为基线。术后第9日CT0进行丙泊酚麻醉,10 mg·kg-1诱导,30mg·（kg·h）-1维持10 min后改为25 mg·（kg·h）-1维持3 h。麻醉结束翻正反射恢复后立即进行生理指标监测,连续采集72 h采集睡眠、体温、活动度等生理信号并进行分析。（2）丙泊酚麻醉对血清褪黑素的影响:SD大鼠随机分为对照组（Control）、丙泊酚组（Propofol）。Propofol组于CT0进行3 h丙泊酚麻醉;Control组给予等体积脂肪乳剂作为溶剂对照。麻醉结束后间隔3 h通过眼底窦静脉采血一次,以翻正反射恢复作为第一个采样时间点,至次日相同时间结束。采用ELISA法检测内源性褪黑素水平。2.褪黑素改善丙泊酚麻醉后节律紊乱作用及机制研究（1）褪黑素对丙泊酚所致睡眠与节律紊乱的改善作用:SD大鼠进行植入子手术,术后第8日通过无线生理信号遥测系统采集24 h信号作为基线。将大鼠随机分为丙泊酚组（Propofol）和褪黑素（Melatonin）处理组。Melatonin组基线记录完成当晚开始连续7天CT12给予褪黑素(15 mg·kg-1,ig),丙泊酚组给予等体积溶剂。术后第14日,Propofol组和Melatonin组于CT0进行丙泊酚麻醉,10mg·kg-1诱导,30 mg·（kg·h）-1维持10 min后改为25 mg·（kg·h）-1维持3h。麻醉后采用无线生理信号遥测系统采集生物电信号24 h,使用睡眠分析软件进行睡眠、体温、活动度等生物节律相关分析。（2）褪黑素对丙泊酚麻醉后内源性褪黑素节律的影响:SD大鼠随机分为3组,每组5只,分别为:对照组（Control）、丙泊酚组（Propofol）、褪黑素（Melatonin）。Melatonin组连续7天于CT12（晚08:00）给予褪黑素(15 mg·kg-1,ig),Propofol组与Control组给予相同体积5%聚氧乙烯蓖麻油。Propofol组与Melatonin组大鼠于第8日CT0进行丙泊酚10 mg·kg-1诱导,30 mg·（kg·h）-1维持10 min后改为25 mg·（kg·h）-1维持3 h,Control给予等体积脂肪乳剂。麻醉结束后间隔3 h通过眼窦静脉进行采血,以麻醉后翻正反射恢复作为第一个点采集,直至次日相同时间结束。采用ELISA法检测内源性褪黑素浓度。（3）褪黑素对Ca MKⅡ-CREB信号通路、时钟因子及其翻译后修饰过程的影响:SD大鼠随机分3组,每组5只,分别为:对照组（Control）、丙泊酚组（Propofol）、褪黑素（Melatonin）。Melatonin组连续7天于CT12（晚08:00）给予褪黑素(15 mg·kg-1,ig),Propofol组与Control组给予相同体积5%聚氧乙烯蓖麻油。Propofol组与Melatonin组大鼠于第8日CT0进行丙泊酚10 mg·kg-1诱导,30mg·（kg·h）-1维持10 min后改为25 mg·（kg·h）-1维持3 h,Control组给予等体积脂肪乳剂。麻醉结束翻正反射恢复后立即取下丘脑和松果体组织,Western检测PER2、CRY2、CLOCK、BMAL1、GSK3β、p GSK3β、SIRT1、AMPK、AANAT、ASMT、p-CREB/CREB、p-Ca MKⅡ/Ca MKⅡ蛋白表达水平。（4）褪黑素对氧化应激相关指标的影响:SD大鼠随机分为对照组（Control）、丙泊酚组（Propofol）、褪黑素（Melatonin）。Melatonin组连续7天于CT12（晚08:00）给予褪黑素(15 mg·kg-1,ig),Propofol组与Control组给予相同体积5%聚氧乙烯蓖麻油。Propofol组与Melatonin组大鼠于第8日CT0进行丙泊酚10 mg·kg-1诱导,30 mg·（kg·h）-1维持10 min后改为25 mg·（kg·h）-1维持3 h,Control组给予等体积脂肪乳剂。麻醉结束后立即取血和下丘脑组织,其中血清通过TBA法、WST-1法及微板法分别检测MDA及GSH含量、SOD活性;下丘脑组织通过流式细胞术检测ROS表达水平,比色法检测NADP/NADPH指标。实验结果1.丙泊酚对生物节律的影响（1）丙泊酚麻醉对睡眠相关生物节律的影响生理信号分析结果表明,24 h睡眠分布图中,动物的睡眠基线呈现昼多夜少特征;体温、自发活动基线则在夜间达到高峰,与龋齿类动物的日常节律一致。丙泊酚组在麻醉后24 h睡眠、体温与活动节律基本丧失,从麻醉后48 h开始恢复,到72 h基本恢复基线水平。睡眠结构分析表明,丙泊酚麻醉后睡眠未发生显著改变;各阶段睡眠片段数量增加,以活动清醒和慢波睡眠（Slow wave sleep,SWS）最为明显;睡眠-觉醒总转化次数增加。（2）丙泊酚麻醉后血清褪黑素的影响ELISA检测结果显示,24 h内源性褪黑素浓度具有昼夜节律性,夜间分泌达峰。丙泊酚组给药后24 h褪黑素浓度稳定于较高水平,昼夜差异幅度降低,失去节律性。2.褪黑素对丙泊酚所致睡眠与节律障碍的改善作用及机制研究（1）褪黑素对丙泊酚所致睡眠障碍的改善作用无线生理信号分析结果表明,与丙泊酚组相比,褪黑素可在一定程度上逆转丙泊酚所致的睡眠、体温以及活动节律紊乱,使各节律指标与对照组保持在同一水平。睡眠阶段分布图显示,与基线相比,丙泊酚组麻醉后24 h睡眠时间略有增加;丙泊酚麻醉显著增加SWS睡眠片段数量并缩短SWS睡眠平均持续时间;丙泊酚麻醉显著增加睡眠-觉醒总转化次数。与丙泊酚组相比,褪黑素将SWS睡眠片段数量和持续时间恢复至基线水平并降低总转化次数。（2）褪黑素改善丙泊酚麻醉所致内源性褪黑素节律紊乱与对照组相比,模型组24 h褪黑素浓度升高伴节律消失;与模型组相比,褪黑素可降低24 h褪黑素浓度并恢复其昼夜节律。（3）褪黑素对Ca MKⅡ-CREB信号通路、时钟因子及其翻译后修饰过程的影响。Western Blot结果表明,与对照组相比,丙泊酚组PER2、CRY2、GSK3β蛋白表达降低,p-Ca MKⅡ/Ca MKⅡ、p-CREB/CREB、CLOCK、BMAL1、p GSK3β、SIRT1、AMPK、AANAT、ASMT蛋白表达增加;与丙泊酚组相比,褪黑素可升高PER2、CRY2、GSK3β蛋白表达水平,抑制p-Ca MKⅡ/CAMKⅡ、p-CREB/CREB、CLOCK、BMAL1、p GSK3β、SIRT1、AMPK、AANAT、ASMT蛋白表达。（4）褪黑素对氧化应激相关指标的影响:氧化应激相关试剂盒结果,与对照组相比,丙泊酚组MDA含量升高、NADP/NADPH比值升高、SOD活性下降、GSH含量降低;与丙泊酚组相比,褪黑素可降低MDA含量、降低NADP/NADPH比值、升高GSH含量、增强SOD活性。流式细胞结果表明,与对照组相比,丙泊酚组下丘脑细胞中ROS水平显著升高;与丙泊酚组相比,褪黑素可抑制下丘脑细胞中ROS生成。实验结论本研究在验证临床剂量丙泊酚诱导睡眠与节律障碍的基础上对褪黑素干预作用进行评价,发现褪黑素具有改善睡眠与生物节律的作用,其作用机制可能与调节核心时钟因子表达和氧化-还原平衡有关。