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目的胶质瘤是成人最常见的颅内原发性肿瘤。尽管目前采用以手术切除肿瘤为主,辅以放疗和化疗的综合治疗方案,但胶质瘤患者的预后仍然很差。通过对胶质瘤遗传及分子机制的不断认识和深入了解,一些新的治疗策略包括肿瘤信号传导抑制/靶向治疗,胶质瘤干细胞靶向治疗和免疫治疗等引起了广泛的关注。Ras超家族成员参与多种细胞信号传导,是细胞和发育过程中的重要调节因子,同时也参与调控肿瘤的发生和进展。例如突变的KRAS-4B激活下游的信号分子,然后促进肿瘤细胞的增殖并且诱导对肿瘤治疗的低反应性。作为Ras超家族中的一员,ARL2参与调节微管动力学和线粒体功能。最近,在多种恶性肿瘤中,ARL2被认为是评估预后和治疗的靶点。但是,ARL2在胶质瘤中的生物学功能尚不清楚。在本实验中,我们通过RT-PCR、免疫组化和western blot检测ARL2在胶质瘤组织中的表达。利用TCGA、CGGA和Rembrandt数据库数据评估ARL2与患者预后的关系。通过慢病毒转染使ARL2在U251和U87细胞系中过表达。利用CCK-8实验、克隆形成实验、transwell侵袭实验和皮下移植瘤模型研究ARL2的生物学功能,探讨ARL2在胶质瘤增殖、侵袭和体内成瘤中的作用及机制。研究方法:1、细胞培养人胶质瘤细胞系U251和U87培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,置于37℃含5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。2、Real-time PCR应用TRIzol（Invitrogen）从12例临床样本和U87、U251细胞系中提取总RNA。总RNA被逆转录并扩增成cDNA。使用TransStartòTop Green qPCR SuperMix试剂盒（Transgen Biotech,AQ131）在Roche LightCycler 480系统进行Real-time PCR检测。mRNA表达以GAPDH mRNA表达水平为基准,采用2-ΔΔCt法进行数据分析。3、Western Blot应用全细胞裂解液（Wanleibio）提取组织和细胞的总蛋白,BCA法进行蛋白定量。每个样品含30μg总蛋白经12%SDS PAGE胶电泳并转移到PVDF膜（0.45μm）上。一抗4℃孵育PVDF膜过夜。应用TBST清洗PVDF膜,孵育二抗,在ECL化学发光成像系统（Tanon,5500）检测蛋白表达。GAPDH做为内参,应用Imagine J软件对条带强度进行定量分析。4、免疫组化组织标本经4%多聚甲醛固定并用石蜡包埋,制备切片。切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水,抗原修复、3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶后,应用山羊血清孵育切片。切片置于湿盒中孵育一抗4℃过夜。用PBS清洗,室温孵育偶联生物素的羊抗兔IgG（SP-9001,ZSGB-BIO）15分钟。应用DAB显色。苏木素复染切片3分钟。然后切片脱水,应用盖玻片封片。5、细胞免疫荧光每个共聚焦小皿中接种5000个细胞,37°C含5%CO2培养箱中培养24小时。然后细胞用4%多聚甲醛固定,0.3%Triton X-100通透。5%BSA封闭后,加入一抗4℃孵育过夜。然后孵育标记罗丹明的山羊抗兔IgG（Proteintech,SA00007-2）和DAPI（BOSTER,AR1176）,应用荧光显微镜（OLYMPUS,BX53）拍照。6、慢病毒转染细胞ARL2、AXL过表达和对照慢病毒购自中国上海吉凯公司。根据使用说明将慢病毒转染到U87和U251细胞中。应用qPCR和Western Blot检测转染效率。7、CCK-8检测细胞增殖在96孔板中每孔接种5000个细胞,于37°C含5%CO2的培养箱中培养6天。在第0、2、4和6天分别向每孔中加入10μl CCK-8（DojinDo）,37℃孵育4小时后,应用酶标仪（BIO-RAD 15033）检测450nm吸光度的OD值。根据每孔的OD值绘制生长曲线。8、平板克隆形成实验收集细胞并制成单细胞悬液。在六孔板中每孔接种500或者1000个细胞,培养在37℃含5%CO2的孵箱中。2周后弃掉培养基,应用结晶紫染液染色。显微镜（Leica,090-135.001）下计数集落（>10个细胞）数量。9、流式细胞仪检测细胞周期收集细胞并用预冷的PBS洗涤。每1毫升含106个细胞的细胞悬液使用70%冷乙醇500μl 4℃固定过夜。PBS洗涤后,加入RNase A 100μl（KeyGEN）37℃孵育30分钟。然后加入400μl碘化丙啶（KeyGEN）避光、4°C 30分钟。应用流式细胞仪（FACS,Becton-Dickinson）进行检测。10、划痕实验在六孔板中每孔接种5×105个细胞。24小时后待细胞铺满,应用200μl枪头划痕。用PBS洗去细胞碎片和悬浮细胞。加入新鲜无血清培养基,继续在37℃含5%CO2条件下培养。在0、24和48小时于同一位置取样拍照。11、Transwell侵袭实验100μl稀释的基质胶（与无血清DMEM以1:8比例稀释）,铺在transwell小室（小室底膜孔径8μm）底部,保存在孵箱中。4小时后在下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基750μl;上室中加入200μl无血清培养基,含105个细胞。细胞在37℃含5%CO2的环境中培养16小时。取出小室用棉签清除小室底部的基质胶和细胞。4%多聚甲醛固定后,应用结晶紫染液染色;每孔选择5个高倍镜视野计数穿过底膜的细胞。12、裸鼠皮下成瘤实验选择6周龄的裸鼠（BALB/C-Null）12只进行皮下成瘤实验。裸鼠购于北京维通利华实验动物技术公司。裸鼠饲养在SPF条件的无菌层流柜中。将12只裸鼠平均分为两组,ARL2过表达组和对照组,每组各6只。在每只裸鼠背部皮下注射0.3毫升含107个细胞的细胞悬液。每4天应用游标卡尺测量肿瘤大小,肿瘤体积计算公式:体积=（长径×短径2）/2。接种28天后将小鼠处死,取瘤称重拍照。13、生物信息学分析通过CGGA、TCGA和Rembrandt数据库中ARL2的表达和患者预后数据分析ARL2在胶质瘤中的表达和预后价值。通过GEO芯片（GSE50161;GSE4290）分析ARL2在胶质瘤和正常脑组织中的表达差异。应用基因富集分析（GSEA,www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）获得ARL2的功能信息。通过pathDIP（http://ophid.utoronto.ca/pathdip/）寻找ARL2相关的信号通路。14、统计学分析两组间比较统计学差异采用t检验,多组间比较统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）。统计学分析采用Microsoft Excel 2013和Graphpad Prism 7.0。P<0.05认为有统计学差异。结果:1、ARL2在胶质瘤中低表达,与胶质瘤患者预后相关。通过Real-time PCR、Western Blot和免疫组化检测ARL2在胶质瘤中mRNA和蛋白表达水平,发现ARL2在胶质瘤组织中低表达;通过进一步挖掘GEO芯片、TCGA、CGGA和Rembrandt数据库的信息,确定ARL2在胶质瘤中低表达,与胶质瘤级别相关。同时挖掘TCGA、CGGA和Rembrandt数据库中预后信息,ARL2低表达的胶质瘤患者预后差。2、ARL2过表达抑制胶质瘤细胞增殖、克隆形成、侵袭和体内成瘤能力。通过慢病毒转染,构建稳定过表达ARL2的U251和U87细胞系。CCK8和克隆形成实验提示ARL2过表达抑制胶质瘤细胞的增殖和克隆形成能力;流式细胞仪分析细胞周期,发现ARL2过表达后,G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期比例减少,呈现G0/G1期阻滞;划痕实验和Transwell侵袭实验显示ARL2上调抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭能力;裸鼠皮下成瘤实验表明ARL2过表达后抑制胶质瘤细胞体内成瘤能力。3、AXL是ARL2下游靶基因。通过GSEA和DAVID分析,提示ARL2与AXL、EGFR、PI3K和MAPK信号通路相关。利用Western Blot检测AXL、p-AXL、ERK、p-ERK、AKT和p-AKT的表达,发现上调ARL2抑制AXL、p-AXL和p-ERK表达。细胞免疫荧光证实ARL2过表达的U251细胞系中,AXL表达下调。裸鼠皮下瘤免疫组化染色提示ARL2高表达的组织中AXL表达下调。上述实验结果表明AXL是ARL2的下游靶基因。4、ARL2通过下调AXL表达抑制胶质瘤增殖和侵袭。在ARL2过表达的U251细胞系中,利用慢病毒转染上调AXL表达,观察细胞增殖和侵袭功能变化。CCK-8和克隆形成实验提示AXL过表达能逆转ARL2造成的胶质瘤细胞增殖能力下降;划痕实验和Transwell侵袭实验表明AXL过表达逆转了ARL2导致的胶质瘤细胞侵袭能力的下降。结论:1、ARL2在胶质瘤组织中低表达,低表达ARL2与胶质瘤患者不良预后相关。2、过表达ARL2抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和体内成瘤能力。3、在胶质瘤中,ARL2通过下调AXL的表达抑制胶质瘤增殖和侵袭。