【摘 要】
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目的:研究PM2.5低浓度长期暴露与高浓度间歇暴露对雄性大鼠生殖系统的毒性作用,并通过体内和体外实验探讨其毒性作用的分子机制。方法:24只6周龄SPF级雄性Wistar大鼠按体重均衡分3组:对照组、PM2.5低浓度持续暴露组与PM2.5高浓度间歇暴露组。暴露组动物利用PM2.5在线浓缩动物染毒平台进行染毒,环境PM2.5浓度浓缩4倍与8倍分别作为低浓度持续暴露组与高浓度间歇暴露组的暴露浓度。低浓度
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目的:研究PM2.5低浓度长期暴露与高浓度间歇暴露对雄性大鼠生殖系统的毒性作用,并通过体内和体外实验探讨其毒性作用的分子机制。方法:24只6周龄SPF级雄性Wistar大鼠按体重均衡分3组:对照组、PM2.5低浓度持续暴露组与PM2.5高浓度间歇暴露组。暴露组动物利用PM2.5在线浓缩动物染毒平台进行染毒,环境PM2.5浓度浓缩4倍与8倍分别作为低浓度持续暴露组与高浓度间歇暴露组的暴露浓度。低浓度持续暴露组每天连续暴露8h,高浓度间歇暴露组每间隔1h暴露1h,每天暴露4次,共计8h。暴露实验共持续12周。暴露结束后对大鼠睾丸组织进行病理学检查、TUNEL检测、超微结构检测。ELISA法检测睾丸组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）的含量和氧化应激标志物超氧化物歧化酶（SOD）的活力以及促炎因子白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。使用不同浓度PM2.5颗粒物悬浮液（0,20,40,80,160,320 μg/ml）分别处理大鼠原代睾丸精原细胞和睾丸间质细胞,使用BD双染试剂盒和流式细胞仪检测睾丸精原细胞和间质细胞的凋亡情况。细胞毒性检测采用乳酸脱氢酶（LDH）活性试剂盒,DNA损伤情况采用8-OHdGELISA试剂盒检测。大鼠睾丸组织、睾丸精原细胞和间质细胞中相关蛋白的表达使用Western blot方法来检测。结果:1.睾丸组织病理学检查结果显示,与对照组相比,低浓度持续暴露组睾丸组织曲精管间质水肿、增宽,有蛋白浆液渗出;高浓度间歇暴露组曲细精管间质明显增宽,部分曲细精管细胞层次减少,生精细胞结构排列紊乱甚至出现缺失。TUNEL结果显示,发生凋亡的细胞数量在对照组中较少,而低浓度持续暴露组和高浓度间歇暴露组均出现了较多的凋亡细胞,且高浓度间歇暴露组发生凋亡的数量要比4倍组浓缩PM2.5恒定暴露组多。超微结构检测结果显示,对照组曲细精管基膜具有均匀、平滑、致密的结构,核外覆盖有电子密度均匀的顶体,细胞核染色质致密,尾部可以看见线粒体鞘,管腔内常见精子头部的不同位置切面。低浓度持续暴露组曲细精管基膜厚薄不均,多呈波浪式皱褶,部分精子尾部线粒体空泡化,高浓度间歇暴露组则相较低浓度持续暴露组皱褶更为严重,并且可以发现有少数精子顶体脱离细胞核。2.睾丸组织中氧化应激标志物及炎性因子水平:与对照组相比,低浓度持续暴露组和高浓度间歇暴露组大鼠睾丸组织中GSH-Px和SOD的活力均降低,而MDA含量则升高,且高浓度间歇暴露组大鼠睾丸组织中的MDA含量高于低浓度持续暴露组。与对照组相比,低浓度持续暴露组和高浓度间歇暴露组睾丸组织中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平显著升高,且高浓度间歇暴露组相对低浓度持续暴露组升高幅度更大。3.睾丸原代细胞的存活率和凋亡情况:CCK-8的结果表明,与对照组相比,精原细胞和间质细胞在80、160、320 μg/mL浓度组细胞存活率显著下降,间质细胞在80 μg/mL组下降更为明显;流式细胞检测结果表明随着PM2.5处理浓度的不断加大,两种原代细胞的凋亡率在不断上升,在80、160、320 μg/mL浓度组非常显著上升。4.睾丸原代细胞的毒性效应和DNA损伤情况:经过不同浓度PM2.5处理后,睾丸精原细胞和间质细胞的LDH释放率均在逐步增加,精原细胞在80、160、320μg/mL浓度组增加较为显著,而间质细胞在40μg/mL浓度组已经出现显著增加。随着PM2.5处理浓度的增加,两种原代细胞8-OHdG的表达量均在逐步增加,80、160、320 μg/mL浓度组增加较为显著。5.睾丸组织、原代细胞中内质网应激与凋亡相关蛋白的表达:在睾丸组织中,与对照组相比,PM2.5暴露低浓度持续暴露组和高浓度间歇暴露组的三条内质网UPR通路PERK/IRE1/ATF6均已激活,而关键蛋白 CHOP、GRP78 和 Caspase-12表达上调。凋亡相关蛋白 Caspase-3、Caspase-9、Bax表达显著增加,而Bcl-2蛋白表达显著下降。与低浓度持续暴露组相比,高浓度间歇暴露组的内质网应激和细胞凋亡情况更严重,动物实验的结果也同样出现在睾丸间质细胞和精原细胞中。结论:长期低浓度持续吸入PM2.5与长期高浓度间歇暴露PM2.5均可使大鼠睾丸组织产生氧化应激反应和炎症反应,引发大鼠睾丸组织病理学损伤,PM2.5暴露通过氧化应激触发内质网应激途径,引起大鼠睾丸组织和睾丸原代细胞凋亡。且高浓度间歇暴露PM2.5比低浓度持续暴露PM2.5对睾丸组织的损伤更为严重。
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