论文部分内容阅读
已知精子发生过程中许多细胞特异性和发育阶段特异性蛋白质的合成和降解是依赖于泛素一蛋白酶体系统。本论文主要研究是从人睾丸组织发现一个新的E3泛素连接酶TRIM69,找到多个其泛素化修饰的蛋白,研究这些特异蛋白泛素化修饰后参与的细胞生理病理过程,间接了解TRIM69的功能,为下一步研究其在精子发生过程中的作用打好基础。TRIM69是我们室从人睾丸cDNA文库扩增得到的一个新基因,该基因编码蛋白为TRIM69,它含有保守的RING-Finger结构域,B-Box结构域,coiled-coil结构域,是TRIM/RBCC家族一名成员。文献提示TRIM家族很多成员都具有E3泛素连接酶活性,是含有RING结构域的E3泛素连接酶。本室前期工作,一定程度上,表明TRIM69具有E3泛素连接酶活性,我们进一步通过体外泛素化试验,证明TRIM69具有E3泛素连接酶活性。同时筛选到与TRIM69对应的E2泛素结合酶有UbcH2、UbcH6、UbcH5a、UbcH5c和UbcH13/Uev1a。RING结构域的发生点突变和缺失时,TRIM69体外E3泛素连接酶活性明显减弱,说明TRIM69的E3泛素连接酶的活性是依赖于完整的RING-finger结构域的,61位和64位的半胱氨酸是关键位点。另外,在一定范围内,随着反应时间增加,TRIM69的E3泛素连接酶的活性增加。体内泛素化试验显示当加入蛋白酶体抑制剂MG132, TRIM69自身泛素化条带明显增加,提示TRIM69自身泛素化修饰,也许是自身水平调节的一种机制。细胞内免疫荧光实验观察GFP和Flag两种不同标签标记的TRIM69融合蛋白在细胞内定位和分布基本相同,都在细胞浆和细胞核呈聚集体和散在形式分布。为了深入研究TRIM69的功能,需要寻找其相互作用的蛋白质。我们室通过酵母双杂交实验,以N-端去除RING结构域(1-246bp)的序列作为诱饵基因,筛选到一个与TRIM69相互作用的蛋白HUS1。通过免疫沉淀和Pull down方法进一步证明二者能够相互作用。体内外泛素化试验表明,TRIM69能够促进HUS1的泛素化。稳定性试验显示,TRIM69能够促进HUS1降解,蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制该过程,说明TRIM69促HUS1降解是通过蛋白酶体途径进行的。文献提示JAB1 (c-jun-activation-domain binding protein),即c-Jun结合蛋白,能够介导9-1-1复合物通过蛋白酶体途径降解,但文中没有提到参与该过程的E3泛素连接酶,既然TRIM69作为E3泛素连接酶能够促进HUS1降解,那么可否假设,JAB1就是我们要寻找的桥接蛋白参与TRIM69降解HUS1过程呢?首先通过免疫沉淀试验,证明了TRIM69, HUS1, JAB1三个蛋白质是可以形成复合物的。为了进一步验证TRIM69与JAB1的关系,进行免疫沉淀和pull down试验,结果表明,二者可以相互作用,TRIM69与JAB1相互作用部位集中于C端coiled-coil和B30.2结构域。根据文献,JAB1能够介导HUS1降解,我们通过试验,转染不同剂量的JAB1,确证了过表达JAB1是能够促进内源HUS1和Radl蛋白降解,并且呈剂量依赖关系。TRIM69, JAB1以及HUS1之间可以建立联系,为了进一步验证JAB1是否起到桥接蛋白的作用,促内源HUS1降解,共转染TRIM69和JAB1质粒,观察内源HUS1的变化。实验表明,单转JAB1组能够促进内源HUS1的降解,而共转TRIM69组,内源HUS1量有所增加,与之对应的是JAB1的表达量明显减少,该结果提示,TRIM69能否通过调节JAB1水平进而调节HUS1水平呢?为了验证该假设,首先需要确定TRIM69对JAB1水平的影响,JAB1稳定性试验表明TRIM69能够加速外源转染的JAB1降解,蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制该过程,说明TRIM69促JAB1降解是通过泛素蛋白酶体途径进行的。体内泛素化试验显示TRIM69促进JAB1的泛素化,当RING结构域发生点突变,促泛素化作用明显减弱,说明TRIM69 E3泛素连接酶活性依赖于完整RING-finger结构域。已知JAB1与c-Jun结合形成稳定复合物,激活AP-1信号通路,提高下游基因的表达。荧光报告素酶实验以及WB分析结果显示,TRIM69能够降低AP-1通路活性,过表达TRIM69能够降低外源转染表达的JAB1, c-Jun和磷酸化的c-Jun水平。已构建好稳定表达TRIM69的质粒,后续实验将用于研究TRIM69对细胞增殖的影响,该实验正在进行中。