目的:本研究拟采用人肾小管上皮细胞系(HK-2),观察药物对HK-2细胞的毒效应,并检测药物对其相应毒性指标及肾损伤指标的影响,确立特异性评价药物肾毒性的体外检测指标,建立一种基于HK-2细胞评价药物肾毒性的体外方法,应用于药物肾毒性的早期预测,为新药研发早期肾毒性评价与筛选提供技术方法。　　方法:　　1.用单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS法)测定HK-2及人正常肝细胞(Human liver cell line,L-02)在不同接种密度条件下的标准曲线,选择适当吸光度值的接种密度,进一步建立细胞培养6d的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。　　2.在确定了HK-2及L-02细胞接种密度及培养时间的基础上,进一步以肾毒性药物庆大霉素、顺铂以及环孢素A为阳性工具药,同时以没有肾毒性的肝毒性药物硫唑嘌呤为阴性参照,MTS法测定四种药物分别对HK-2及L-02细胞活率的影响,并以细胞活率数据为基础,根据不同浓度药物导致细胞活率变化的曲线采用IC50计算软件线性回归进行拟合求出细胞在体外培养模型中出现10％活率抑制的药物浓度,将IC10作为我们对比药物器官选择性的依据,验证HK-2细胞用于药物肾毒性体外研究的可行性。　　3.以庆大霉素、顺铂、环孢素A及硫唑嘌呤作用于体外培养的HK-2及L-02细胞株,考察四种药物对HK-2细胞的毒性效应:倒置相差显微镜观察给药24h后HK-2细胞形态,MTS法检测药物对HK-2细胞的存活情况,AO/EB荧光染色法观察药物对HK-2细胞的凋亡情况;采用自动生化分析仪检测HK-2及L-02细胞培养上清中相应毒性指标LDH、ALT、AST、ALP、γ-GT的变化,通过对比两种细胞中肝肾毒性药物反映细胞毒性的检测指标来寻找特异反映药物肾毒性的指标。　　4.N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是一种位于溶酶体内的酸性水解酶,主要分布于皮质近曲小管细胞内。当近曲肾小管受到损伤时,尿中NAG的活性显著增高,且较其他酶的增高更早出现,测定NAG对肾小管损害的早期诊断有较大的价值。肾损伤分子-1(KIM-1)作为一种肾小管损伤的生物标志物,是一种1型跨细胞膜蛋白,在正常组织中表达非常低,但在肾损伤时会在去分化的肾近曲小管上皮细胞中高度表达。本研究在已完成的KIM-1可早期预测药物造成肾损伤体内试验的基础上,进一步验证其体外分泌情况是否与体内试验一致,验证其是否可以作为体外评价药物肾毒性的检测指标。以人肾小管上皮细胞(HK-2)作为研究对象,采用体内试验中所用的庆大霉素、顺铂、环孢素A作为受试药物,同时加入一种没有肾毒性的肝毒性药物硫唑嘌呤作为阴性参照,底物显色法检测细胞培养上清中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的释放,ELISA法检测培养上清中肾损伤分子-1(KIM-1)的分泌,重点比较肾损伤标志物NAG、KIM-1与动物体内试验结果、细胞毒性指标的差异,对其体内外相关性及其作为体外肾毒性指标的特异性和敏感性进行确证性研究。　　结果:　　1.根据HK-2及L-02细胞的标准曲线计算出相应的细胞数,绘制两种细胞培养6d的生长曲线,选择进入对数生长期、生长迅速的接种密度,以保证细胞生长达最佳状态,减少由于细胞自身状态的差异所造成的误差。两种细胞均选择了5000cells/孔的接种密度和24h的培养时间。　　2.通过比较四种药物的IC10值发现,3种肾毒性药物庆大霉素、顺铂以及环孢素A的IC10HK-2值均小于IC10L-02,而硫唑嘌呤作为肝毒性药物其IC10HK-2值则大于IC10L-02,说明:HK-2细胞对肾毒性药物比较敏感,结合L-02细胞能够很好地反映药物在各器官毒性的差异性,能够在体外正确地反映药物肾毒性的大小,将该细胞模型应用于药物肾毒性的体外评价与筛选是可行的。　　3.从细胞的形态、存活、凋亡等三个方面考察了药物对HK-2细胞的毒效应,并通过对比四种药物所致HK-2及L-02细胞上清中相应毒性指标的变化,确定了LDH及AST可作为反映细胞毒性的非特异性指标、γ-GT可作为特异反映药物肾毒性的指标,为药物的体外肾毒性评价提供检测依据,进而用于药物肾毒性的评价与筛选。　　4.以人肾小管上皮细胞(HK-2)作为研究对象,采用体内试验中所用的庆大霉素、顺铂、环孢素A作为受试药物,同时加入一种没有肾毒性的肝毒性药物硫唑嘌呤作为阴性参照,考察了不同梯度浓度药物对HK-2细胞分泌NAG、KIM-1的量效关系,发现不同浓度三种肾毒性药物作用于HK-2细胞24h后,在药物较低浓度时即可刺激HK-2细胞中NAG、KIM-1分泌水平的升高,与体内试验中此三种药物诱导的大鼠损伤模型尿中NAG、KIM-1明显升高的结果一致,这表明NAG、KIM-1作为体外肾毒性指标与体内结果具有很好的相关性。而肝毒性药物硫唑嘌呤作为阴性参照,在作用于HK-2细胞24h后未引起HK-2细胞中KIM-1的分泌出现显著性升高,唯有肾毒性的药物在体外可以引起HK-2细胞KIM-1的显著分泌,说明KIM-1在体外的肾损伤评价中具有很好的特异性。而N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体释放的一种酸性水解酶,在四种药物作用HK-2细胞24h后其活性均出现了显著性升高,说明其特异性较KIM-1低,但其仍可作为体外评价药物肾毒性很好的辅助诊断指标。HK-2细胞上清中KIM-1的分泌一般在细胞损伤较轻、凋亡较少的情况下即出现显著升高,在细胞损伤较严重、存活细胞数少的情况下则分泌增加较少,而细胞上清中LDH、AST、γ-GT、NAG的分泌则随着药物处理浓度的升高而增加,一般在细胞明显损伤、凋亡的情况下才出现显著性变化。提示:KIM-1与细胞毒性指标及传统肾损伤指标NAG相比,可以在更低的细胞损伤、凋亡作用下即出现显著性变化,在肾损伤评价中可能具有更高的敏感性和特异性。　　结论:初步建立了基于HK-2细胞评价药物肾毒性的体外方法:首先通过比较药物对HK-2及L-02细胞的IC10值来考察药物毒性的器官选择性,对药物的肾毒性进行初步评价;其次通过考察药物对HK-2细胞的存活、凋亡及毒性指标LDH、AST、γ-GT、NAG、KIM-1的变化综合评价药物的体外肾毒性,为新药研发早期肾毒性评价与筛选提供体外检测方法。