研究背景：MicroRNA是一类高度保守的小分子的非编码RNAs,通过与靶基因mRNA分子3’末端非翻译区域特异性结合,负性调控转录后的基因表达。已证实miRNA广泛存在于各种真核细胞中,参与生命过程的一系列过程,包括细胞生长发育,细胞增殖、分化,细胞凋亡等。其中miR-1, miR-133和miR-206被证实主要作用在肌原细胞或成肌细胞增殖、分化为成熟肌管的过程中。骨骼肌是人体最大的组织,它的收缩和舒张活动是人体各种运动的基础。各种外界刺激可能引起骨骼肌细胞细微损伤、凋亡以及坏死等,与此同时骨骼肌也可不断地进行修复和再生。骨骼肌的再生修复过程主要是由外部力学因素和内部细胞因素两者共同协调完成的一个非常复杂且呈多阶段的过程。然而骨骼肌自身修复的能力有限,严重的骨骼肌损伤恢复不佳会极大的影响人们的运动能力和生活质量,并且随着骨骼肌损伤的发病率越来越高,有关骨骼肌损伤后修复、再生和重建的细胞、分子以及力学水平的机制研究日益受到研究者们的重视,一种结合细胞分子水平和力学刺激治疗骨骼肌损伤的新方法殛待被发现。1993年,Lee RC等在秀丽新小杆线虫c.elegans中意外地发现了一种定时调控胚胎后期发育的miRNA-lin4,它是一种非编码RNA,长度为22nt。2000年,miRNA-let7的发现掀起了寻找miRNA的热潮。近几年,随着生物信息学的发展,分子克隆技术的改进和模式物种cDNA文库的建立,相继又在线虫、果蝇、Hela细胞等许多真核模式生物和细胞中找到了数百种相似的小分子RNA,并将其称为miRNA (microRNA)。MicroRNA是小分子的进化上高度保守的非编码RNAs,其由RNA聚合酶Ⅱ转录作为编码一个或多个miRNAs的长前体miRNAs。大部分miRNA作为独立的转录本被转录,但大约有1/3嵌在蛋白编码基因的内含子中,被前信使RNAs剪接。Pri-miRNAs在胞核中经蛋白质Drosha和DGCR8剪切,产生一个60～70bp的具有发夹样结构的RNA,称为前体miRNA(precursor miRNA, pre-miRNA),Exprotin-5将其由胞核运至胞质,在胞质中Dicer酶将其剪切成为21～25bp的双链RNA。这个双链RNA由Dicer酶上释放,在解螺旋酶作用下分离,其中一条单链与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex, RISC)结合,与目标mRNAs互补,发挥miRNA功能,另一条立即被降解。miRNAs通过与靶mRNA3’UTRs序列特异性互补,调节基因表达,导致翻译抑制或使mRNA失去稳定性。对靶mRNA结合特异性互补的主要决定因素是由miRNA5’末端Watson-Crick2-8个碱基配对核苷酸决定,称为“种子序列”。然而,这个区域外的核苷酸作为mRNA3’UTR序列环绕区域的二级结构,同样影响mRNA抑制,且其miRNA的靶向定位与开放读框有关。microRNA与其靶基因的互补程度决定其作用模式：1、microRNA与靶mRNA完全互补结合,切割靶mRNA。2、microRNA与靶mRNA不完全互补结合,抑制靶蛋白翻译而不影响mRNA稳定性。3、同时具有以上两种作用模式。肌组织特异表达的三种miRs:即miR-1, miR-133和miR-206,它们被证实主要作用在肌原细胞或成肌细胞增殖、分化为成熟肌管的过程中。体外组织培养细胞可模拟体内肌肉增殖分化过程。使用C2C12细胞模型系统,过表达和敲除实验已应用于研究肌肉miRNA的功能。在C2C12成肌细胞中过表达的miR-1和miR-206可促进细胞分化,而过表达的miR-133可促进细胞增殖,抑制其分化。相反,抑制内源性的miR-1/206和miR-133,可导致对成肌细胞增殖、分化相反的影响。miR-1和miR-133源于相同的miRNA多顺反子,并一起转录,但miR-1和miR-133具有相反的作用。进一步研究证明miRNA可能在细胞增殖和分化的平衡中起着重要作用,miR-1和miR-133在小鼠骨骼肌肥大模型中表达水平均下降,这种表达改变是对骨骼肌超载的适应性反应。miR-206是在骨骼肌组织中表达含量最多的,且是目前所知唯一一个由骨骼肌特异表达的micorRNA,miR-206对早期肌卫星细胞的迁移也有一定的作用。由于miR-206在肌萎缩侧索硬化症中的有益作用,被称为是骨骼肌纤维和神经双向信号传导的关键调节者,它可通过感应运动神经元损伤,促进神经肌肉突触的代偿性再生。最近的研究表明miR-1, miR-133和miR-206可促进骨骼肌损伤后的修复,在小鼠撕裂的胫前肌部位局部注射miR-1, miR-133和miR-206的混合物,1周后与对照组比较可在形态和功能上显著地增强骨骼肌的重建,因此,局部加强miR-1,133和206的含量或表达在骨骼肌损伤方面可能成为一个新的治疗手段。miRs的表达往往受到另外一些调节因子的调节,在骨骼肌再生过程中,miR-1, miR-133和miR-206的表达都受到成肌因子(家族中主要包括NMyoD, myogenin, MRF4和Myf5等)的调节。MyoD和一些生肌素(如SRF, Mef2)可结合miR-1-1,miR-1-2, miR-133a-1, miR-133a-2和miR-206基因的上游增强子,直接调节这些miRs的表达。一个包含miR-206/133b的多聚赖氨酸转录被鉴定是7H4,一个突触联系的非编码RNA,而7H4的表达在胚胎期、出生后以及在神经移植后的骨骼肌再生过程中都与myogenin/MyoD紧密相连。在局部注射miR-1,133和206促进骨骼肌修复的过程中发现外部给予三种miRs又可反过来上调损伤的骨骼肌中myogenin和MyoD的表达。成肌调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)本身在骨骼肌再生过程中对细胞水平的调节起着非常重要的作用,成肌过程是由于MRFs的表达所激发的。最近有学者提出MRFs在成肌细胞成熟过程中起着核心的作用,诸多对于成肌细胞调节的信号通路最终都殊途同归,都是通过MRFs或目前还未知的非MRFs来起作用的。同时力学刺激对胚胎期和出生后的骨骼肌发育都有着不可替代的作用,在细胞水平上,力学刺激可引起成肌细胞一系列的变化,如细胞增殖、分化、代谢、修复和存活。胚胎期由于骨的生长所造成的外部力学刺激引起骨骼肌的发育,出生后被动的力学刺激可增加骨骼肌蛋白合成和肌体积从而促进骨骼肌生长。适度的力学拉伸在体外可通过调节C2C12细胞中MyoD的表达从而促进细胞的增殖与分化。合适的力学刺激才能促进细胞的生长,周期性力学拉伸比静态牵拉内皮细胞更能促进新生血管及其分支的形成。既往研究表明缓慢的运动有利于改善肌肉的质量,而剧烈的运动反而抑制成肌细胞的增殖。外部力学刺激是通过一定的信号途径把力学信号转变为细胞内信号的,这种确切的传导机制目前尚不是十分清楚。研究较多的是p38MAPK和NF-κ B信号通路。最近的研究表明力学拉伸条件下p38MAPK是通过激活NF-κB信号通路诱导C2C12成肌细胞分化,因此,我们把重点放在NF-κB通路上。NF-κB是广泛存在于胞浆中的一种快反应转录因子,通常以p65-p50二聚体的形式存在,与抑制物I-κB (inhibitor of NF-κB, I-κB)结合而呈非活性状态,NF-κB活化后能够进入核内,与DNA上的特异位点(κB位点)结合,调节包括生长因子、转录因子、细胞素、趋化因子以及抗凋亡蛋白等在内的基因转录。在约为11N/cm2的拉力强度下,机械拉伸小鼠横隔膜可通过激活NF-κB通路诱导Ankyrin重复域2(Ankyrin repeat domain2,Ankrd2) mRNA和蛋白表达显著增强。后者的表达在体外和体内对力学刺激都是高度灵敏的,因此被称为拉伸反应基因,而Ankrd2的表达被证明与MyoD和Myogenin之间存在交互效应。mdx小鼠由于体内缺乏抗肌萎缩蛋白的表达,力学拉伸容易造成mdx小鼠骨骼肌损伤,外部力学拉伸mdx小鼠腹壁肌和股二头肌15min时即可引起NF-κB的核转录,30min时达到高峰。而且,NF-κB信号通路可调控心肌组织的收缩功能、生长、坏死和炎症反应,生理和病理的外部刺激大多数都是通过NF-κB信号通路对心肌细胞起作用的。本课题首先拟利用Flexcell FX5000细胞拉力系统,对C2C12成肌细胞进行周期性的力学拉伸,采用基因测序、qRT-PCR、Western blot等手段探讨周期性力学拉伸C2C12成肌细胞引起细胞增殖分化过程中,NF-κB信号通路与由成肌因子介导的miRs的表达之间的交互作用；其次,利用基因测序技术,探讨其他的一些新的miRs在力学拉伸促进成肌细胞增殖过程中的作用。综上所述,miRNA领域拓宽了对转录后基因表达调节机制的理解。人类蛋白编码基因的1/3以上受到miRNAs的调控,提示在肌肉生物学许多方面,miRNA发挥着巨大的潜在功能。在许多类型的骨骼肌疾病中,miRNA表达模式显著改变,人类骨骼肌肌肉疾病miRNAs的表达鉴别可能成为新的诊断治疗靶标。同时,适当的力学刺激对骨骼肌损伤的修复也起着重要的作用。由此我们设想,在骨骼肌损伤修复过程中改变miRs的表达并辅以适当的力学刺激是否会有效地促进骨骼肌损伤的修复,此有待进一步研究,其机制将为骨骼肌损伤的治疗提供新的思路。目的：1、探讨不同周期性拉伸的运动条件对成肌细胞增殖与分化的影响,同时利用基因测序技术探讨力学拉伸影响成肌细胞增殖分化过程中miRs的表达变化。2、分析在力学拉伸引起成肌细胞增殖分化过程中NF-κB通路和由成肌因子介导的miRs的表达之间的相互关系。3、探讨其他的一些新的miRs在力学拉伸促进成肌细胞增殖过程中的作用。方法：1、力学加载和细胞培养技术根据美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置(Flexcell FX5000tension),按照不同周期性拉伸的频率、幅度和拉伸时间对C2C12成肌细胞进行正弦波拉伸,加载程序由FX5000计算机软件自动控制,使用该加载装置可以很方便地研究成肌细胞生长和应力的关系。2、细胞增殖的测定利用CCK-8试剂在酶标仪(选择450nm波长)中测定各拉伸组和对照组的光吸收值(OD值),以筛选出促增殖的拉伸条件。3、力学拉伸后成肌细胞miRs的表达变化对照组及加载组KNA提取和microRNA基因测序(样品分离、数据分析等均由公司完成)。4、力学拉伸引起成肌细胞增殖与分化过程中信号途径分析提取对照组和加载组的RNA、总蛋白及核蛋白,采用qRT-PCR、Western blot等方法进行分析：第一步,不添加任何阻断试剂,分析NF-κB、MyoD、myogenin以及microRNA的基因或蛋白的表达。第二步,在NF-κB抑制剂存在的条件下,再用相同的强度和频率力学拉伸成肌细胞,检测其增殖与分化情况,并检测MyoD、myogenin以及microRNA的表达。结果：1、力学拉伸促进C2C12增殖过程中microRNA表达谱的变化应用CCK-8试剂,对0Hz(对照组)、0.125Hz、0.25Hz和0.5Hz4组所测的OD值进行单因素方差分析,统计分析结果提示0.125Hz组与对照组比较有统计学意义,p<0.05,且其平均值高于对照组,提示对细胞增殖有促进作用。其他两组与对照组比较无统计学差异,且平均值低于对照组。结果表明低频率周期性机械拉伸可促进成肌细胞的增殖。通过高通量测序发现,表达有差异且p值<0.05的microRNA共10个。通过qRT-PCR验证的有7个,其中上调的是：niR-1941-3p,其中下调的是：miR-500-3p, miR-1934-5p, miR-31-3p, miR-378a-5p, miR-331-3p, miR-5097.差异microRNA预测靶点的KEGG通路分析结果显示,与骨骼肌损伤修复有关的通路有：肌萎缩侧索硬化(ALS),磷脂酰肌醇信号系统,B细胞受体信号通路,MAPK信号通路等,这其中MAPK信号通路与骨骼肌相关的研究报道较多。以上结果表明,低频率的周期性机械拉伸可促进成肌细胞的增殖,而高频率的拉伸却不能促进成肌细胞增殖,从而筛选出促增殖的拉伸条件。通过基因测序分析发现了一些差异表达的microRNA,这些microRNA可能通过多种机制对成肌细胞增殖进行调节,其中较重要的有MAPK信号通路。MAPK可通过磷酸化和调节一些转录因子和染色质重构蛋白来实现对成肌细胞的调节。这一初步研究结果为进一步研究外部力学拉伸和细胞内信号调节在骨骼肌损伤修复过程中的机制提供一定基础。2、成肌因子介导的microRNAs表达和NF-KB通路之间存在着交互关系应用CCK-8试剂,2.5μM BAY(NF-κB抑制剂)拉伸组、5μM BAY(NF-κB抑制剂)拉伸组分别与对照组所测的OD值进行两样本的t检验,统计分析结果提示5μM BAY拉伸组与对照组比较有统计学意义,p<0.001,且其OD值明显低于对照组,提示对细胞增殖有抑制作用。而2.5μM BAY拉伸组与对照组比较无统计学差异。结果表明NF-κB抑制剂的浓度大于5μM时明显抑制成肌细胞的增殖。通过western blot实验结果显示：在内参表达基本一致情况下,5μMBAY拉伸组的NF-κB的表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义,p<0.001。此实验说明5μM BAY明确抑制了NF-κB通道。同样选取第一章中0.125Hz拉伸组和对照组相比有差异表达的7个microRNA进行qRT-PCR实验。结果与第一章中的结果相反,5μM BAY拉伸组和对照组相比,7个microRNA的表达发生了变化,其中下调的是：miR-1941-3p,其中上调的是：miR-500-3p,miR-1934-5p,miR-31-3p,miR-378a-5p,miR-331-3p,miR-5097,而其中差异有统计学意义的是miR-378a-5p,miR-331-3p,miR-5097, miR-1941-3p.同时通过qRT-PCR实验结果发现,0.125Hz拉伸组和对照组相比,MyoD(肌分化因子)和Myogenin(生肌因子)的基因表达是上调的,而加入NF-κB抑制剂的5μM BAY拉伸组和对照组相比,MyoD(肌分化因子)和Myogenin(生肌因子)的基因表达是明显下调的,这些差异表达均有统计学意义,p<0.01。上述结果说明在通过力学拉伸促进细胞增殖的过程中,抑制NF-κB通路,可以改变miRNA,MyoD和Myogenin的表达,进而影响细胞的再生和增殖,他们三者之间存在交互关系,在外部力学拉伸促进细胞增殖方面起着重要的作用。3、三种miRs在力学拉伸促进成肌细胞增殖过程中的作用高通量测序相较于普通基因测序的一个主要优势是高通量测序可发现一些新的miRs。我们在对对照组和拉伸组进行高通量测序过程中,发现了11种在两组共同表达,且表达有差异的新的miRs。分别是：mir-12, mir-14, mir-16, mir-17, mir-20, mir-36, mir-39, mir-4, mir-42, mir-44, mir-6。其中差异有统计学意义的有3种:mir-44, mir-36, mir-20, Log2fold change分别为：-6.713,1.109,1.189。对有差异有统计学意义的有3种miRs,即]mir-44, mir-36, mir-20,进行qRT-PCR验证实验,结果与高通量测序结果一致。进一步对差异有统计学意义的3种miRs进行KEGG通路分析,包括的信号通路有：Vascular smooth muscle contraction, Atrazine degradation, Notch signaling pathway, phototransduction等。其中与骨骼肌修复有关的研究中,Notch信号通路的报道较多。以上结果说明其他一些新的miRs可能是通过影响多种信号通路,如Notch信号通路来促进成肌细胞增殖的。结论：1、低频率的周期性机械拉伸可促进成肌细胞的增殖,而高频率的拉伸却不能促进成肌细胞增殖。通过基因测序分析发现拉伸组和对照组存在microRNA表达谱的差异。2、力学拉伸促进细胞增殖的过程中,抑制NF-κB通路,可以改变microRNA, MyoD和Myogenin的表达,进而影响细胞的再生和增殖,他们三者之间存在交互关系。3、通过高通量测序,在拉伸组和对照组的比较中发现了一些新的microRNA,它们可能通过Notch信号通路来促进成肌细胞增殖。