背景在世界范围内,心肌梗死（myocardial infarction,MI）仍然是导致人类死亡的首要原因,多由冠状动脉急性闭塞或严重狭窄引发持续缺血和缺氧所导致,继而造成活性氧（reactive oxygen species,ROS）大量产生,引起心肌损伤和心肌细胞（cardiomyocyte,CM）死亡。ROS在MI的发生发展中起关键作用,可直接损伤细胞和细胞器膜,导致CM凋亡和坏死、炎症细胞因子的增加、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的降解和纤维化微环境的形成。同时,坏死的CMs会激活免疫系统并产生严重的炎症反应,并通过促进ROS的进一步升高形成恶性循环,导致梗死面积的二次扩大。ROS升高和炎症反应也加速了损伤心肌组织纤维化和左心室病理性重构的发生和发展。随着时间的推移,心脏功能逐渐恶化,最终导致充血性心力衰竭（heart failure,HF）的发生。研究表明早期清除ROS可以减少CM死亡,减少炎症因子的产生和ECM的降解,减轻后续损伤。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是体内天然抗氧化防御系统的重要组成部分,它可以将超氧自由基（superoxide radical,O2·-）催化成H2O2和O2,在医疗领域有广泛的应用潜力。然而,许多缺点极大地限制了天然SOD在治疗中的应用,如容易失活、高成本和无特异性靶向性。而其广泛应用的主要障碍是酶在加工过程中暴露于高温和/或非水介质时非常容易失活。随着材料与生物科技的蓬勃发展,科研工作者们已经发现并使用了多种方法来克服酶的脆弱性,例如固定化策略。金属有机骨架（metal-organic framework,MOF）结构是新近用于固定和优化天然酶的代表性纳米材料（nanomaterial,NM）,具有易于修饰的化学功能和可控的孔尺寸,已经被用于在生物相容性合成条件（H2O,室温）下固定特定的酶,可以轻松地把酶与其反应产物相分离,从而提高其稳定性和催化效率,并具有其它多孔材料无法达到的精度和更广阔的发展空间。由于基于锆（zirconium,Zr）的化合物具有良好的生物相容性,同时也表现出良好的机械性能,因此在生物医学的研究领域广泛应用。并且,已经有许多研究使用基于Zr基MOF（ZrMOF）的NMs进行体内和体外实验,均证明了 ZrMOF具有良好的生物相容性。然而,迄今为止,还没有ZrMOF在心血管领域的研究和应用。所以本研究采用优化体积的SOD作为抗氧化材料,将具有良好组织相容性ZrMOF的作为其载体,合成了一种具有纳米级尺寸和SOD酶活性的新型固定化酶,SOD-ZrMOF。我们首次将SOD-ZrMOF应用于MI后心肌损伤修复的研究中。第一部分 SOD-ZrMOF的制备与表征目的制备具有纳米级尺寸和SOD酶活性的新型固定化酶,SOD-ZrMOF,鉴定其表征,并检测其SOD酶活性和体内稳定性。方法1 水热法合成ZrMOF,经化学键连接构建SOD-ZrMOF。2 通过SEM、TEM和DLS对SOD-ZrMOF进行表征。3 CLSM以逐层扫描的方式研究SOD-ZrMOF的三维结构特征。4 使用SOD检测试剂盒测定SOD和SOD-ZrMOF的酶活性。5 将FITC标记的SOD或SOD-ZrMOF等量注射到小鼠心肌组织中,使用荧光成像技术观察心脏上的荧光信号强度,以评估SOD-ZrMOF是否具有比SOD更优的稳定性。结果1 SEM结果显示SOD-ZrMOF为均匀规则的正八面体结构,其平均直径为96 nm,与空白ZrMOF的SEM图像高度相似;SOD-ZrMOF的TEM图像也呈现出相似的形貌特征;DLS实验测出SOD-ZrMOF的平均流体动力学粒径约为154 nm,略大于 ZrMOF（133 nm）。2 CLSM结果显示,FITC的绿色荧光和罗丹明6G的红色荧光从上方到中间逐渐增强,然后从中间到底部逐渐减弱,且两种荧光的最强、最弱和变化的层面都是一致的,即SOD和ZrMOF在三维空间内具有相同的分布特征。3 SOD-ZrMOF和游离SOD的酶活性无统计学差异。4 荧光成像结果显示SOD-ZrMOF在小鼠体内具有比SOD更强的稳定性。结论本研究以化学键连接的方式将合成了一种新型固定化酶,SOD-ZrMOF。体外和动物研究结果证明了 SOD-ZrMOF是一种具有均匀规则的正八面体结构的纳米级固定化酶,并且具有高水平的SOD酶活性和更优的体内稳定性。第二部分 SOD-ZrMOF对缺氧心肌细胞的保护作用及相关机制研究目的细胞水平验证SOD-ZrMOF的细胞毒性、对ROS的清除能力以及对缺氧CMs的保护作用和相关机制。方法1 CCK-8法检测ZrMOF和SOD-ZrMOF对H9c2细胞的细胞毒性。2 CCK-8法检测在缺氧条件下ZrMOF和SOD-ZrMOF对H9c2细胞是否具有保护作用,并确定SOD-ZrMOF处理H9c2细胞的最佳浓度。3 DCFH-DA探针法检测在缺氧条件下ZrMOF和SOD-ZrMOF是否能够清除H9c2细胞产生的ROS。4 JC-1探针检测SOD-ZrMOF在缺氧和常氧条件下对H9c2细胞线粒体膜电位去极化率的作用。5 活/死细胞染色和细胞凋亡检测法验证SOD-ZrMOF在缺氧和常氧条件下对H9c2细胞是否具有保护作用。6 Western blot法检测SOD-ZrMOF在缺氧条件下对H9c2细胞NF-κB/HIF-1α通路的激活是否具有抑制作用。结果1 ZrMOF和SOD-ZrMOF在所检测的浓度范围内对H9c2细胞无细胞毒性。2 缺氧条件下ZrMOF对H9c2细胞的细胞活力是没有保护作用的,而SOD-ZrMOF可显著减轻缺氧对H9c2细胞的细胞活力造成的影响。3 常氧环境下ZrMOF和SOD-ZrMOF对H9c2细胞的ROS水平没有影响;缺氧环境会导致H9c2细胞的ROS水平显著提高;ZrMOF对缺氧条件下H9c2细胞的ROS水平没有影响,而SOD-ZrMOF可以显著降低缺氧条件下H9c2细胞的ROS水平。4 常氧环境下SOD-ZrMOF对H9c2细胞的线粒体膜电位水平没有影响;缺氧环境会导致H9c2细胞的线粒体膜电位显著失衡;SOD-ZrMOF在缺氧条件下对H9c2细胞线粒体膜电位失衡有明显的抑制作用。5 缺氧环境会导致H9c2细胞的凋亡和坏死显著增多;SOD-ZrMOF对常氧环境下H9c2细胞的存活没有不良影响,但显著抑制了缺氧H9c2细胞的凋亡和坏死。6 缺氧条件下SOD-ZrMOF对H9c2细胞NF-κB/HIF-1α通路的激活具有显著的抑制作用。结论在细胞水平的研究中,SOD-ZrMOF在所检测的浓度范围内对H9c2细胞无细胞毒性,并且可以通过清除缺氧条件下过量产生的ROS保护CMs的线粒体功能,并进一步保护CMs免于缺氧诱导的凋亡和坏死。而SOD-ZrMOF对NF-κB/HIF-1α通路的抑制作用可能是其治疗缺氧导致细胞损伤的关键机制。第三部分 SOD-ZrMOF对心肌梗死模型小鼠的短期疗效及相关机制研究目的动物水平验证SOD-ZrMOF的生物相容性、对MI导致的急性心肌组织损伤的保护作用和相关机制。方法1 给予健康小鼠心肌内注射SOD-ZrMOF,72h后采集血清和主要脏器进行生化检测和HE染色以评估其急性毒性。2 构建小鼠MI模型后立即给予SOD-ZrMOF或PBS心肌注射,同时构建Sham组,24h后取血清,用ELISA法检测各组小鼠的炎症因子水平。3 取各组小鼠的心肌组织,用Western blot法检测NF-κB/HIF-1α通路的蛋白表达水平;制作心肌组织切片,用免疫荧光法验证HIF-1α蛋白的表达水平。4 用TUNEL法检测SOD-ZrMOF对CMs凋亡水平的影响。结果1 血生化和HE染色结果显示SOD-ZrMOF对小鼠的心肌损伤标志物、肝功能、肾功能、各主要脏器的形态结构和炎症细胞浸润水平均无不良影响。2 相比于Sham组,MI后24 h模型小鼠的炎症因子水平和NF-κB/HIF-1α通路的蛋白表达水平显著升高,受损心肌组织中CMs凋亡显著增多。而SOD-ZrMOF显著减轻了MI急性期的炎症水平,抑制了 NF-κB/HIF-1α通路的激活,减少了 CMs的凋亡。结论SOD-ZrMOF表现出了良好的生物相容性,并通过抑制细胞凋亡、炎症反应和NF-κB/HIF-1α通路激活的方式减轻了 MI导致的急性心肌组织损伤。第四部分 SOD-ZrMOF对心肌梗死模型小鼠远期疗效的研究目的动物水平验证SOD-ZrMOF对MI导致的心肌组织损伤的远期保护作用和相关机制。方法1 构建MI模型小鼠后立即给予SOD-ZrMOF或PBS心肌注射,同时构建Sham组,用心脏超声动态评估各组小鼠的心功能变化。2 4周后测量各组小鼠体重（body weight,BW）,而后取各脏器,测量心脏重量（heart weight,HW）和胫骨长度（tibia length,TI）,计算HW/BW和 HW/TI 比例。3 制作心肌组织切片,通过HE染色、Masson染色和天狼星红染色评估各组小鼠的心肌梗死面积、左心室壁厚度、梗死区域存活细胞比例和胶原纤维沉积情况。4 通过免疫荧光法评估各组小鼠受损心肌组织的血管密度。5 取肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和心脏的非MI组织制作石蜡切片,通过HE染色评估SOD-ZrMOF对各组小鼠的远期毒性。结果1 相比于Sham组,MI模型小鼠的心功能随着时间延长进行性下降,而SOD-ZrMOF显著抑制了上述下降趋势。2 相比干Sham组,MI后4周模型小鼠的HW/BW和HW/TI 比例显著升高,而SOD-ZrMOF显著抑制了上述升高的趋势。3 相比于Sham组,MI后4周模型小鼠的心肌梗死面积和胶原纤维沉积水平显著升高,左室壁厚度显著变薄,MI区域存活细胞比例显著降低,而SOD-ZrMOF治疗显著抑制了上述不良影响。4 心肌内注射SOD-ZrMOF组的血管密度明显高于MI组和Sham组。5 各脏器组织HE染色图片未见明显炎症细胞浸润和结构改变。结论SOD-ZrMOF作为一种新型固定化酶通过心肌注射的方式用于体内的长期研究是安全的。SOD-ZrMOF通过对MI急性期的治疗有效缩小了 MI小鼠远期的心肌梗死面积,提高了受损心肌组织的血管密度,并动态改善了心功能,显著抑制了病理性心室重构的进展。