黑茶藨子△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及功能研究

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huodong004
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γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA,C18:3Δ6,9,12)是人体所需的重要脂肪酸,具有重要的生理功能。重要的油料作物如油菜和大豆等都不含GLA。在高等植物中,只有在月见草、琉璃苣和黑茶藨子(Ribes,nigrum)等少数几种植物种子中含有较高水平的GLA。Δ6-脂肪酸脱氢酶是由亚油酸生成GLA的关键酶。本研究以黑茶藨子为实验材料,通过PCR和基因步移技术,克隆得到黑茶藨子5条含Cyt b5结构域的脱氢酶基因:RnD8A,RnDSB、RnD6C、RnD6D和RnD6E。将获得的基因构建酵母和植物表达载体转入酵母和拟南芥菜鉴定基因的功能,确定RnD8A/B为Δ8-鞘脂脱氢酶基因,RnD6C/D/E为Δ6-脂肪酸脱氢酶基因。将RnD6C/D/E与绿色荧光蛋白基因GFP构建融合基因,对其表达进行定位,发现其在酵母中表达定位于线粒体,而在烟草表皮细胞中定位于内质网。GC-MS检测发现GLA和OTA主要积累于黑茶藨子的种子中,而在其它器官含量很少;RT-PCR结果表明黑茶藨子中GLA和OTA的积累主要来源于种子特异表达的RnD6D的表达。对获得的基因进行融合、突变,考察Δ6-脂肪酸脱氢酶的重要催化位点和底物结合位点,并最终获得了酶催化能力大幅提高的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因和一条优先利用C16:1Δ9的突变Δ6-脂肪酸脱氢酶基因。本研究获得的基因,具有用于油料作物改良的潜能,也为研究植物脱氢酶的进化提供了新的线索,同时也为寻找重要的酶催化活性位点提供了依据。
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