白背三七细胞悬浮培养体系的建立及主要成分分析

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白背三七[Gynura divaricata(L.)DC.]为菊科三七属植物,具有很好的药理作用,被广泛用于治疗高血压病、高脂血症及糖尿病等,是一种良好的药食两用植物。但因全株含有一定含量的致肝毒性吡咯里西啶生物碱(HPAs)及其氮氧化物而使该植物的综合利用受到限制。另白背三七植物受生态环境、自然环境、可耕作面积等的影响使得广泛栽培受到抑制。研究通过组织培养技术脱除白背三七的PAs并利用细胞培养积累有效成分是白背三七资源开发利用的新途径。本论文系统讨论了诱导白背三七愈伤组织和建立悬浮细胞培养体系的技术,通过此植物组织培养技术减少有毒生物碱,并比较分析愈伤组织、悬浮细胞、叶片中常规理化成分、活性成分含量。结果如下:1、从外植体、诱导时期、基本培养基、激素浓度与配比等方面诱导并筛选胚性愈伤组织。结果表明:白背三七带芽嫩叶在MS培养基与1.0mg/L KT+0.5mg/L2,4-D+0.3mg/L NAA+1.0mg/L6-BA激素组合下能快速诱导出愈伤组织,最佳诱导时期为3月份。白背三七在B5培养基与0.5mg/L NAA+2.0mg/L6-BA激素组合下可获得疏松易碎、有光泽、生长旺盛的愈伤组织,呈平缓的“S”型生长曲线,接种后第18d生物量达到最大值19.54g/瓶。2、以胚性愈伤组织建立稳定的白背三七悬浮细胞培养体系,从培养代数、接种密度、装液量、pH值、激素浓度与配比等方面优化生长条件并测定细胞悬浮培养的生长曲线。结果表明:在B5基本培养基+0.5mg/L NAA+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖,pH7.0,装液量为40%,接种密度为90g/L(鲜质量),培养温度(25±2)℃,摇床转数为115r/min,弱光培养条件下,细胞生长呈“S”形曲线;培养过程中,培养基的pH呈先下降后缓慢升高的变化趋势;细胞活力的变化稍滞后于生长曲线,逐渐降低。3、主要采用理化分析方法和HPLC、MS、DAD等检测方法对白背三七干叶、愈伤组织和悬浮细胞的有毒成分、常规成分和抗氧化活性成分进行分析,结果表明:在实验室建立的HPLC检测方法下,测得白背三七干叶中的倒千里光碱含量为11.73μg/g,而愈伤组织和悬浮细胞中基本检测不到此生物碱。白背三七干叶中的灰分、脂质、总三萜的含量高于愈伤组织和悬浮细胞;而粗多糖含量为悬浮细胞中最高,干叶中最少;总黄酮的含量为愈伤组织>干叶>悬浮细胞。白背三七的抗氧化活性成分主要溶解于甲醇溶剂,通过HPLC-MS-DAD方法分析鉴定两种活性物质为绿原酸和咖啡酰奎宁酸,其中含量大小为愈伤组织>悬浮细胞>干叶,愈伤组织中CHA和DCQA的含量分别为0.85和1.7mg/g。
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