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背景子痫前期(PE)是一种多系统的妊娠综合征,也是造成围产期发病率和死亡率升高的主要原因之一,其患病率大约占孕产妇的5～8%。它被定义为妊娠20周以后出现新发的高血压和蛋白尿,或虽无蛋白尿,但合并下列任何一项者:血小板减少;肝功能损害;肾功能损害;肺水肿;新出现的中枢神经系统失常或视觉障碍。虽然目前关于子痫前期的发病机制假说有多种,但其确切机制至今仍不清楚。然而,依据子痫前期患者被确诊时的孕周,以34周为界,又可以把子痫前期分为两个亚型:早发型子痫前期和晚发型子痫前期。早发型子痫前期发病早,病情进展快,临床症状较严重,往往会产生严重的母儿并发症,而晚发型子痫前期发病晚,病情进展迟缓,临床症状较早发型子痫前期轻,其母儿预后结局尚可,据报道,早发型子痫前期和晚发型子痫前期可能具有不同的发病机制。目前绝大多数研究认为,炎症免疫的过度激活是子痫前期非常重要的病理特征,而ACKR2作为一种非典型趋化因子受体,它对CC型炎性趋化因子具有极高的亲和力,可与趋化因子结合,内化并进行降解,进而达到控制炎症、调节免疫的作用。ACKR2主要在淋巴管内皮细胞中表达,有研究发现,ACKR2也可在滋养细胞来源的组织中表达,并具有防止胎盘白细胞过度浸润的作用。然而,关于ACKR2在子痫前期胎盘组织中的研究仍较少,因此本研究以此为切入点,通过分析ACKR2在子痫前期胎盘组织中的表达变化,初步探讨ACKR2在子痫前期发病机制中的作用。目的进一步探索ACKR2在不同类型子痫前期患者胎盘组织中表达变化,及分析这种表达变化与孕周的关系;通过探讨缺氧对滋养细胞系JAR中ACKR2的表达影响及ACKR2沉默后对趋化因子CCL2的表达和细胞凋亡、增殖的影响,分析验证ACKR2在子痫前期发病机制中的作用。实验方法1.选择研究对象:选取由郑州大学第三附属医院科研中心生物样本库工作人员于2017年2月至2018年10月收集的胎盘组织样本共120例,分为四组:正常组(N,n=30),早产组(PB,n=30),早发型子痫前期组(EOPE,n=30)和晚发型子痫前期组(LOPE,n=30)。为了避免不同的分娩方式对实验结果产生影响,选择的各组孕妇均为剖宫产分娩,并排除甲状腺功能减退,妊娠糖尿病,慢性高血压,母体自身免疫性疾病以及双胎妊娠和辅助生殖。2.标本采集:在胎盘娩出后的半小时内,从胎盘母面取两块1×1X1cm大小的组织,用生理盐水洗涤后,一块放于液氮中备用,另一块放于福尔马林溶液中进行固定,用于后续实验。3.采用RT-PCR方法检测ACKR2在四组胎盘组织中的mRNA表达,并采用2-ΔΔCt相对定量法进行数据分析。4.采用免疫组织化学方法检测ACKR2在四组胎盘组织中的蛋白表达,并用图像分析软件进行相关的半定量分析。5.采用Western blot法检测ACKR2在四组胎盘组织中的蛋白表达,并用图像分析软件进行相关的定量分析。6.用氯化钴模拟缺氧条件,使用MTT法分别检测氯化钴在处理细胞24h、36h、48h和72h情况下对细胞增殖活性的影响,并用Western blot法检测不同浓度的氯化钴对滋养细胞来源的人绒毛膜癌细胞系JAR中ACKR2蛋白表达的影响。7.用ACKR2的小干扰RNA转染JAR细胞,并使用RT-PCR法和Western blot法检测细胞中的ACKR2被沉默的效率。8.当JAR细胞中的ACKR2被沉默后,使用流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,使用MTT法检测对细胞增殖的影响,以及分别使用RT-PCR法和Western blot法检测对趋化因子CCL2表达的影响。9.统计学分析:使用统计软件SPSS24.0对数据进行分析,所有数据均用均数±标准误差表示,两组定量资料的比较采用t检验,多组定量资料的比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示有统计学意义。结果1.四个分类组别一般临床资料的比较正常组、PB组、EOPE组和LOPE组的平均收缩压分别为117.70±1.83mmHg、111.62±2.25mmHg、166.63±3.50mmHg 和 157.67±3.94mmHg,平均舒张压分别为86.80±3.18mmHg、70.38±1.59mmHg、105.17±1.74mmHg和97.93±2.21mmHg,就血压(收缩压和舒张压)而言,EOPE组的血压高于正常组和PB组,LOPE组的血压高于正常组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。正常组、PB组、EOPE组和LOPE组的平均新生儿体重分别为3.41±0.05Kg、1.98±0.07Kg、1.47±0.07Kg和2.67±0.13Kg,就新生儿体重而言,正常组高于PB组、EOPE组和LOPE组,而EOPE组低于PB组,且差异都具有统计学意义(P<0.05)。正常组、PB组、EOPE组和LOPE组的平均孕周分别为39.00±0.06W、32.77±0.28W、31.90±0.28W 和 37.01±0.30W,就孕周而言,正常组与 PB 组、正常组与EOPE组、正常组和LOPE组以及PB组和EOPE组之间分别相比较,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。正常组、PB组、EOPE组和LOPE组的平均胎盘重量分别为 0.61±0.02Kg、0.51±0.02Kg、0.47±0.02Kg 和 0.52±0.02Kg,就胎盘重量而言,PB组、EOPE组和LOPE组均低于正常组,差异都具有统计学意义(P<0.05),而PB组与EOPE组之间的差别无统计学意义(P>0.05)。正常组、PB组、EOPE组和LOPE组的平均孕前BMI分别为23.25±0.75Kg/m2、24.26±0.77Kg/m2、24.93±0.85Kg/m2 和 23.93±0.56Kg/m2,分别比较正常组与 PB组、正常组与EOPE组、正常组和LOPE组以及PB组和EOPE组的孕前BMI,其差异均无统计学意义(P>0.05)。正常组、PB组、EOPE组和LOPE组的平均年龄分别为:33.17±0.81 岁、32.07±0.83 岁、32.63±0.93 岁和 30.87±0.88岁,就孕妇年龄而言,分别比较正常组与PB组、正常组与EOPE组、正常组和LOPE组以及PB组和EOPE组之间的差异,发现均无统计学意义(P>0.05)。2.四组间胎盘组织中ACKR2的mRNA和蛋白相对表达水平的比较RT-PCR法显示,与正常组相比,EOPE组和PB组中胎盘ACKR2的mRNA表达水平降低,且差异都具有统计学意义(P<0.05),而正常组和LOPE组、PB组和EOPE组之间分别相比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。Western blot法和免疫组化法显示,EOPE组和PB组中胎盘ACKR2的蛋白表达水平较正常组低(P<0.05),而EOPE组和PB组、LOPE组与正常组之间分别相比较,关于ACKR2蛋白水平的差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.氯化钴对滋养细胞来源的人绒毛膜癌细胞系JAR中ACKR2的影响随着氯化钴作用浓度的升高,JAR细胞的增殖活性逐渐降低。当氯化钴浓度为50μmol/L和100μmol/L时,与对照组相比,细胞中ACKR2蛋白表达的差异不具有统计学意义(P>0.05);但当氯化钴浓度为150μmol/L,200μmol/L和250μmol/L时,与对照组相比,JAR细胞中ACKR2蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.下调ACKR2对细胞凋亡、增殖活性和趋化因子CCL2表达的影响RT-PCR法检测结果显示,细胞中ACKR2的沉默效率为73.9%,且Western blot法检测结果显示,细胞中ACKR2的蛋白表达有明显的沉默效应;而细胞中的ACKR2被沉默后,JAR细胞的凋亡水平增加,增殖活性下降,趋化因子CCL2的mRNA和蛋白表达水平升高。结论1.不同类型子痫前期患者胎盘组织中关于ACKR2的表达是不同的,但这种不同可能也与孕周有一些关联;2.缺氧可以抑制ACKR2蛋白表达;3.ACKR2的下调可以影响滋养细胞的凋亡和增殖及胎盘趋化因子CCL2的表达。