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背景：恶性肿瘤的早期淋巴道转移致患者死亡率高、预后差，其发生机制一直是肿瘤学的研究难题。小鼠肝癌细胞Hca-F和Hca-P具有相同遗传背景，它们来自同一小鼠腹水肝癌细胞克隆的不同亚克隆，且Hca-F为高淋巴道转移力细胞（淋巴结转移率约75%），Hca-P为低淋巴道转移力细胞（淋巴结转移率约25%），是研究肿瘤淋巴道转移的理想细胞模型。Crk最初作为一种癌基因产物发现于禽类肉瘤病毒CT10（chicken tumor10）中，主要由SH2(src homology2)和SH3结构域组成。Crk家族包括三个成员：CrkⅠ、CrkⅡ和CrkL，在各种组织中广泛表达。信号接头蛋白CrkL（Crk-Like）是Crk家族成员之一，近年来研究表明：CrkL异常表达与肿瘤生物学行为密切相关，但CrkL与肝癌淋巴道转移的关系鲜有报道。本研究组前期通过Western blot发现，CrkL在小鼠高、低淋巴道转移力细胞株Hca-F和Hca-P中表达差异显著，其在Hca-P中的表达是Hca-F中的3.05倍（P<0.05），提示CrkL的表达水平与肿瘤淋巴道转移密切相关，可能是潜在的抑制肝癌淋巴道转移的靶标分子。本研究通过RNA干扰技术，下调CrkL在Hca-P中的表达，进一步探索CrkL对肿瘤淋巴道转移细胞生物学行为的影响。目的：1、构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表达载体并稳定转染至小鼠肝癌低淋巴道转移力细胞Hca-P中，获得CrkL表达稳定下调的Hca-P细胞株；2、研究CrkL下调对Hca-P细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响；3、研究CrkL下调对Hca-P细胞致鼠成瘤性和淋巴结转移潜能的影响。方法：1、依据CrkL的mRNA序列（GenBank：BC131984），利用siDirect和whitehead软件设计针对CrkL的siRNA，同时设计无关序列作为阴性对照。利用Lipofectamine2000介导法，将构建好的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表达载体及pGPU6/GFP/Neo-shRNA-control无关序列表达载体分别转染至Hca-P细胞中，24h后荧光显微镜下观察转染效率，经400μg/ml G418筛选及有限稀释法获得稳定转染的Hca-P单克隆细胞株。采用Western blot验证各组单克隆细胞、单克隆无关序列细胞及Hca-P细胞株中CrkL蛋白的表达水平。2、CCK-8法测定CrkL下调对Hca-P细胞增殖能力的影响；Transwell小室测定CrkL下调对Hca-P细胞迁移及侵袭能力的影响；3、小鼠足垫种植法分析CrkL下调对小鼠足垫成瘤性及淋巴结转移等生物学行为的影响。结果：1、设计了3条针对CrkL的siRNA，且成功构建了3种重组质粒：pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-707、 pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-732和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL-560并筛选得到15株单克隆细胞株。Western blot结果表明：相对于阴性对照组，在707-7、732-3和560-4单克隆细胞中CrkL在蛋白水平明显下调，其下调率分别为63.34%、93.12%和96.15%，可作为后续功能实验细胞株。2、CCK-8细胞增殖检测结果显示707-7、732-3和560-4单克隆细胞在培养96h时间点增殖迅速，显著高于阴性对照组（P<0.05）；Transwell小室细胞迁移和侵袭检测结果显示707-7、732-3和560-4单克隆细胞的迁移数及侵袭数明显多于阴性对照组（P<0.05）；3、体内动物实验结果表明，CrkL下调促进小鼠足垫的成瘤性及淋巴结转移率。结论：1、成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-CrkL表达载体；获得15株CrkL表达稳定下调且干扰效率不同的单克隆细胞株，为进一步研究CrkL在肝癌淋巴道转移中的作用奠定了基础；2、CrkL下调能够促进Hca-P细胞的增殖、迁移和侵袭能力；3、CrkL下调能够促进小鼠足垫的成瘤性及体内淋巴结转移率；4、CrkL在肝癌细胞生物学行为中发挥重要作用，有望成为新的肝癌基因治疗的分子靶点。