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【研究背景】
规律并逐渐增强的宫缩对于产程的进展至关重要，但是关于宫缩的启动及维持机制目前尚不清楚。分娩过程中的节律性宫缩使子宫肌处于缺氧复氧状态，类似于心肌组织的缺血再灌注状态。对于缺血复氧状态对于子宫肌的影响机制，目前缺乏有效的体外动物及细胞模型。因此，本研究组拟首先体外培养原代子宫平滑肌细胞，并通过研究不同氧浓度、不同缺氧和复氧时间对肌细胞活力及凋亡率的影响，首次构建子宫平滑肌细胞的缺氧复氧模型，从体外细胞水平模拟子宫收缩(缺氧/复氧状态)，进一步探讨人子宫肌层平滑肌细胞对缺血缺氧的耐受阈值及其可能机制，并通过检测细胞活性及凋亡率验证模型的构建是否成功。同时，本研究组的前期研究提出，自噬在分娩宫缩过程中被激活，可能是维持宫缩的机制之一。因此，体外建立缺氧/复氧（H/R）模型以模拟在体节律性宫缩过程中子宫平滑肌缺血再灌注状态，拟进一步证实缺氧/复氧处理条件下子宫平滑肌细胞的自噬状态及损伤凋亡状态，为探讨分娩过程中宫缩的调节及维持机制，为临床宫缩异常的防治提供新的思路，为产力异常提供治疗靶点。
第一部分：人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养及鉴定
【目的】
分离培养获得高纯度的人妊娠子宫平滑肌细胞，是研究人子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的实验基础。通过检测分离的细胞中平滑肌肌动蛋白SMA的表达评价子宫平滑肌细胞的分离纯化效果，为进一步的模型构建和功能实验打下基础。
【材料与方法】
材料：取足月初产妇剖宫产（以臀位为手术指征）术中子宫下段切口之上缘肌组织约5mm×5mm×5mm，(本研究经广州医科大学伦理委员会批准，组织应用均征得患者同意，伦理号NO.2018041701)。
方法：采用组织块贴壁法进行人妊娠子宫平滑肌原代培养，并用形态学和免疫荧光染色平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleacting，SMA)进行细胞鉴定。
【结果】
分离纯化的人妊娠子宫平滑肌原代细胞（humanmyometrialsmoothmusclecells,hMSMCs)，胞浆SMA荧光染色阳性，细胞纯度达99%以上
【结论】
成功培养了人妊娠子宫平滑肌原代细胞，胞浆SMA荧光染色阳性，细胞纯度达99%以上。
第二部分：构建人妊娠子宫平滑肌细胞缺氧/复氧模型
【目的】
为研究子宫平滑肌的宫缩机制，本研究拟采用低氧细胞工作站建立人妊娠子宫平滑肌细胞缺氧/复氧模型，为进一步探讨人子宫肌层平滑肌细胞对缺氧的耐受阈值及其可能机制奠定基础。
【材料与方法】
实验分组：
A.正常对照组（细胞不做任何处理）
B.不同氧浓度组：分为4组，对照组，2%氧浓度缺氧24h组，3%氧浓度缺氧24h组,5%氧浓度24h组，确定模型最佳氧浓度。
C.缺氧复氧组（H/R组，在不同的缺氧时间及复氧时间处理条件）
i.不同缺氧时间组：选择最佳氧浓度，然后分为5组：对照组，缺氧6h复氧2h组，缺氧12h复氧2h组，缺氧24h复氧2h组，缺氧36h复氧2h组，确定最佳缺氧时间。
ii.不同复氧时间组：选择最佳缺氧时间，然后实验分为4组：对照组，复氧2h组，复氧3h组，复氧4h组，确定最佳复氧时间。
方法：采用低氧工作站混合气体培养法构建子宫平滑肌缺血/复氧模型，通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，采用CCK-8法检测细胞活性。
【结果】
1.确定最佳氧浓度：培养原代子宫平滑肌细胞,建立细胞缺氧复氧模型，利用cck-8法检测肌细胞的存活率变化。在不同氧浓度处理条件下，与对照组相比，在2%及5%氧浓度处理条件下，细胞活性分别为100±0.98，0±0，104.78±0.49及37.55±0.87，细胞活性显著下降，具有统计学意义（p＜0.05）。
2.确定最佳缺氧时间：利用cck-8法检测肌细胞的存活率变化及Annexin-V/PI流式细胞仪检测细胞凋亡率。在3%氧浓度下缺氧0、6、12、24h复氧2小时处理条件下细胞活性分别99±0.98、91.22±2.33、95±0.21、104.78±0.49（p＞0.05），而在缺氧36h后细胞的存活率显著性下降（p＜0.05），有显著统计学意义(p＜0.05)。
3.确定最佳复氧时间：选定3%氧浓度缺氧24h处理条件，利用cck-8法检测肌细胞的活性变化，复氧2、3、4h后细胞活性分别为99±0.98，104.78±0.49，82.45±1.28，38.57±2.3，随着复氧时间的延长，细胞活性反而下降（p＜0.05）。
【结论】
3%氧浓度缺氧24h复氧2h为缺氧复氧最佳模型，在此模型的体外人子宫平滑肌细胞活性处于最佳状态。体外人妊娠子宫平滑肌细胞缺氧复氧模型构建成功。
第三部分：子宫平滑肌细胞缺氧/复氧模型中自噬的激活状态
【目的】
本课题组前期研究证实了分娩过程中子宫平滑肌存在着自噬激活现象，为进一步验证本课题组的前期研究，采用体外原代培养子宫平滑肌细胞的缺氧/复氧模型，观察缺氧条件下自噬情况。
【材料与方法】
实验分组：正常对照组、3%氧浓度缺氧24h复氧2h组。
方法：本部分利用低氧工作站建立低氧微环境，通过透射电子显微镜观察子宫平滑肌自噬小体；采用qPCR法检测自噬相关蛋白LC3表达。
【结果】
1、通过透射电镜观察：与对照组相比，3%氧浓度下缺氧24h复氧2h后，子宫平滑肌细胞内自噬小体及自噬溶酶体等自噬结构明显增多，有显著统计学意义（P＜0.05）。
2、RealTimePCR结果显示，与对照组相比，3%氧浓度下缺氧24h复氧2h后细胞内LC3mRNA表达量明显增加（P＜0.05），有统计学意义。
【结论】
人妊娠子宫平滑肌细胞在3%氧浓度缺氧24h复氧2h状态下，自噬激活。
规律并逐渐增强的宫缩对于产程的进展至关重要，但是关于宫缩的启动及维持机制目前尚不清楚。分娩过程中的节律性宫缩使子宫肌处于缺氧复氧状态，类似于心肌组织的缺血再灌注状态。对于缺血复氧状态对于子宫肌的影响机制，目前缺乏有效的体外动物及细胞模型。因此，本研究组拟首先体外培养原代子宫平滑肌细胞，并通过研究不同氧浓度、不同缺氧和复氧时间对肌细胞活力及凋亡率的影响，首次构建子宫平滑肌细胞的缺氧复氧模型，从体外细胞水平模拟子宫收缩(缺氧/复氧状态)，进一步探讨人子宫肌层平滑肌细胞对缺血缺氧的耐受阈值及其可能机制，并通过检测细胞活性及凋亡率验证模型的构建是否成功。同时，本研究组的前期研究提出，自噬在分娩宫缩过程中被激活，可能是维持宫缩的机制之一。因此，体外建立缺氧/复氧（H/R）模型以模拟在体节律性宫缩过程中子宫平滑肌缺血再灌注状态，拟进一步证实缺氧/复氧处理条件下子宫平滑肌细胞的自噬状态及损伤凋亡状态，为探讨分娩过程中宫缩的调节及维持机制，为临床宫缩异常的防治提供新的思路，为产力异常提供治疗靶点。
第一部分：人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养及鉴定
【目的】
分离培养获得高纯度的人妊娠子宫平滑肌细胞，是研究人子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的实验基础。通过检测分离的细胞中平滑肌肌动蛋白SMA的表达评价子宫平滑肌细胞的分离纯化效果，为进一步的模型构建和功能实验打下基础。
【材料与方法】
材料：取足月初产妇剖宫产（以臀位为手术指征）术中子宫下段切口之上缘肌组织约5mm×5mm×5mm，(本研究经广州医科大学伦理委员会批准，组织应用均征得患者同意，伦理号NO.2018041701)。
方法：采用组织块贴壁法进行人妊娠子宫平滑肌原代培养，并用形态学和免疫荧光染色平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleacting，SMA)进行细胞鉴定。
【结果】
分离纯化的人妊娠子宫平滑肌原代细胞（humanmyometrialsmoothmusclecells,hMSMCs)，胞浆SMA荧光染色阳性，细胞纯度达99%以上
【结论】
成功培养了人妊娠子宫平滑肌原代细胞，胞浆SMA荧光染色阳性，细胞纯度达99%以上。
第二部分：构建人妊娠子宫平滑肌细胞缺氧/复氧模型
【目的】
为研究子宫平滑肌的宫缩机制，本研究拟采用低氧细胞工作站建立人妊娠子宫平滑肌细胞缺氧/复氧模型，为进一步探讨人子宫肌层平滑肌细胞对缺氧的耐受阈值及其可能机制奠定基础。
【材料与方法】
实验分组：
A.正常对照组（细胞不做任何处理）
B.不同氧浓度组：分为4组，对照组，2%氧浓度缺氧24h组，3%氧浓度缺氧24h组,5%氧浓度24h组，确定模型最佳氧浓度。
C.缺氧复氧组（H/R组，在不同的缺氧时间及复氧时间处理条件）
i.不同缺氧时间组：选择最佳氧浓度，然后分为5组：对照组，缺氧6h复氧2h组，缺氧12h复氧2h组，缺氧24h复氧2h组，缺氧36h复氧2h组，确定最佳缺氧时间。
ii.不同复氧时间组：选择最佳缺氧时间，然后实验分为4组：对照组，复氧2h组，复氧3h组，复氧4h组，确定最佳复氧时间。
方法：采用低氧工作站混合气体培养法构建子宫平滑肌缺血/复氧模型，通过倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，采用CCK-8法检测细胞活性。
【结果】
1.确定最佳氧浓度：培养原代子宫平滑肌细胞,建立细胞缺氧复氧模型，利用cck-8法检测肌细胞的存活率变化。在不同氧浓度处理条件下，与对照组相比，在2%及5%氧浓度处理条件下，细胞活性分别为100±0.98，0±0，104.78±0.49及37.55±0.87，细胞活性显著下降，具有统计学意义（p＜0.05）。
2.确定最佳缺氧时间：利用cck-8法检测肌细胞的存活率变化及Annexin-V/PI流式细胞仪检测细胞凋亡率。在3%氧浓度下缺氧0、6、12、24h复氧2小时处理条件下细胞活性分别99±0.98、91.22±2.33、95±0.21、104.78±0.49（p＞0.05），而在缺氧36h后细胞的存活率显著性下降（p＜0.05），有显著统计学意义(p＜0.05)。
3.确定最佳复氧时间：选定3%氧浓度缺氧24h处理条件，利用cck-8法检测肌细胞的活性变化，复氧2、3、4h后细胞活性分别为99±0.98，104.78±0.49，82.45±1.28，38.57±2.3，随着复氧时间的延长，细胞活性反而下降（p＜0.05）。
【结论】
3%氧浓度缺氧24h复氧2h为缺氧复氧最佳模型，在此模型的体外人子宫平滑肌细胞活性处于最佳状态。体外人妊娠子宫平滑肌细胞缺氧复氧模型构建成功。
第三部分：子宫平滑肌细胞缺氧/复氧模型中自噬的激活状态
【目的】
本课题组前期研究证实了分娩过程中子宫平滑肌存在着自噬激活现象，为进一步验证本课题组的前期研究，采用体外原代培养子宫平滑肌细胞的缺氧/复氧模型，观察缺氧条件下自噬情况。
【材料与方法】
实验分组：正常对照组、3%氧浓度缺氧24h复氧2h组。
方法：本部分利用低氧工作站建立低氧微环境，通过透射电子显微镜观察子宫平滑肌自噬小体；采用qPCR法检测自噬相关蛋白LC3表达。
【结果】
1、通过透射电镜观察：与对照组相比，3%氧浓度下缺氧24h复氧2h后，子宫平滑肌细胞内自噬小体及自噬溶酶体等自噬结构明显增多，有显著统计学意义（P＜0.05）。
2、RealTimePCR结果显示，与对照组相比，3%氧浓度下缺氧24h复氧2h后细胞内LC3mRNA表达量明显增加（P＜0.05），有统计学意义。
【结论】
人妊娠子宫平滑肌细胞在3%氧浓度缺氧24h复氧2h状态下，自噬激活。