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目的吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)是中药吴茱萸的有效成分,已有研究证明吴茱萸碱具有较强的抗肿瘤作用,并且起效浓度较低,对多种肿瘤细胞均具有诱导其凋亡的效果。通过基因芯片研究发现,吴茱萸碱通过抑制多条通路的表达,从而促进肿瘤细胞的凋亡,其中涉及肿瘤特异糖代谢(Warburg效应)相关调控通路,继而对糖代谢通路中某些关键酶产生影响。本论文将以吴茱萸碱为主,探讨其对肿瘤特异糖代谢的作用及机制。方法一、运用Real-Time qPCR技术探讨不同时间点吴茱萸碱对肿瘤特异糖代谢通路和相关酶,以及凋亡基因的影响,包括HIF1-a、Akt、PFK、PRPP合成酶(PRS1)、caspase9基因的表达情况；二、使用Western blot技术检测吴茱萸碱对糖代谢相关酶以及凋亡相关蛋白的蛋白表达影响；三、运用MTT方法检测不同浓度吴茱萸碱及其与紫杉醇联合用药对人肝癌细胞HepG2的肿瘤抑制作用；四、流式细胞术检测吴茱萸碱及其与紫杉醇联合对HepG2细胞的凋亡作用,五、荷瘤小鼠体内探讨吴茱萸碱对小鼠肝癌转移瘤的抑制作用,设置正常对照组、模型组、5-Fu 10mg/kg阳性组、吴茱萸碱40mg/kg药物组、吴茱萸碱80mg/kg药物组观察肿瘤的生长及抑制情况。结果一、Real-Time qPCR技术检测吴茱萸碱对肿瘤特异糖代谢相关酶基因PFK、 PRPP合成酶(PRS1)、Warburg效应相关调控通路HIF1-a、Akt的基因,以及凋亡相关基因caspase9的作用。通过吴茱萸碱作用于肝癌细胞HepG20h、12h、24h后检测糖代谢相关酶基因PFK、PRPP合成酶(PRS1)、Warburg效应相关调控通路HIF1-a、Akt以及凋亡相关基因caspase9的基因表达情况,结果发现吴茱萸碱作用12h和24h后,糖代谢相关酶基因PFK、PRPP合成酶(PRS1)基因以及Warburg效应相关调控通路当中HIF1-a, Akt基因与模型组相比均有不同程度的下调作用,凋亡基因caspase9与模型组相比有上调作用。以上表明吴茱萸碱药物作用下能下调糖代谢相关酶基因和Warburg效应相关调控通路基因的表达,也能上调凋亡基因,从而抑制了肿瘤的生长及诱导其凋亡。二、Western blot技术检测吴茱萸碱对糖代谢相关酶蛋白及相关凋亡蛋白表达影响吴茱萸碱作用于肝癌细胞HepG20h、12h、24h、36h,检测PFK等蛋白的表达情况,结果发现12h、24h吴茱萸碱作用下糖代谢关键酶PFK蛋白的表达受到抑制,核糖核苷酸还原酶(RR)蛋白的表达24h受到抑制；凋亡相关蛋白p53蛋白表达下调,凋亡蛋白Caspase912h出现上调表达。以上初步说明吴茱萸碱对糖代谢相关酶蛋白的表达有抑制效果,但是其抑制肿瘤生长及诱导其凋亡并没有通过p53途径进行,而是从其他的通路调节从而抑制肿瘤生长。三、吴茱萸碱及其与紫杉醇联合对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用用不同浓度的吴茱萸碱和不同浓度的紫杉醇以及联合用药观察对肝癌细胞HepG2的增效作用,0.3μmol/L吴茱萸碱联合0.005μmol/L紫杉醇、0.3μmol/L吴茱萸碱联合0.01μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吴茱萸碱联合0.005μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吴茱萸碱联合0.01μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吴茱萸碱联合0.005μmol/L紫杉醇、0.6μmol/L吴茱萸碱联合0.01μmol/L紫杉醇作用于HepG2细胞抑制率分别为30%：±0.007、40%±0.002、42%±0.01、49%±0.02、46%±0.04、51.3%±0.03,Q值分别为1.58、1.13、1.85、1.28、1.19、1.00,并且由结果可知吴茱萸碱的抑制肿瘤生长及杀伤作用具有浓度依赖性,较低浓度的吴茱萸碱与较低浓度的紫杉醇联合用药对肝癌细胞HepG2具有协同增效的作用,Q值几乎都大于1.15。四、流式细胞术检测吴茱萸碱与紫杉醇对HepG2细胞的凋亡作用通过流式细胞术检测,发现吴茱萸碱与紫杉醇单药作用于细胞均能产生一定的细胞凋亡效应,而两药联合使用细胞凋亡效应增强,说明吴茱萸碱与紫杉醇联合用药对HepG2细的促凋亡效应有增效作用。五、荷瘤小鼠体内探讨证吴茱萸碱对小鼠肝癌转移瘤的抑制作用H22小鼠肝癌细胞接种后,通过设置模型组、5-Fu阳性组(10mg/kg)、吴茱萸碱40mg/kg组、吴茱萸碱80mg/kg组观察肿瘤的生长抑制情况。结果发现5-Fu阳性组(10mg/kg)、吴茱萸碱40mg/kg组与模型组相比肿瘤均有不同程度的抑制作用,抑瘤率分别是65.4%,44.78%,吴茱萸碱80mg/kg组没有抑瘤作用,原因可能是高浓度药物对小鼠产生炎症反应或者副作用,亦或者是药物溶出率太低从而不能发挥抑瘤作用。结论吴茱萸碱具有较强的抗肿瘤药效,通过其对肿瘤特异糖代谢相关酶和Warburg效应相关调控通路的机制研究发现：吴茱萸碱能抑制肿瘤特异糖代谢相关酶基因和Warburg效应相关调控通路的表达,从而抑制肿瘤的生长及诱导肿瘤细胞凋亡；吴茱萸碱联合紫杉醇诱导肝癌细胞HepG2有协同增效的作用。