视网膜神经细胞的损伤包括诸多因素，但其最终的表现为神经元DNA损伤导致的细胞凋亡和细胞坏死。其中，DNA双链断裂(Double—strand breaks，DSBs)是DNA损伤最严重的一种形式。DNA的修复能力对于细胞保持其基因组的完整性具有非常重要的意义，若损伤的DNA无法得到及时、有效修复，将导致细胞死亡。非同源末端连接(DNA non—homologous end—joining，NHEJ)是神经元DSBs的主要修复方式，对神经元的存活有很重要的意义。 Ku及BRCA1是DNA非同源末端连接修复的主要蛋白，在增殖细胞中起关键的修复作用；但在终末分化的神经元，两者都沉默。近年来有研究提出，随着中枢神经系统(CNS)发育成熟，DNA甲基化程度加强，某些基因启动子区的CpG岛发生甲基化，导致该基因沉默。因此，我们推测Ku及BRCA1沉默可能与其启动子甲基化有关，进而导致神经元损伤时DNA断裂不能及时有效修复。现将本课题的研究目的、方法、结果和结论小结如下： 研究目的： 1.探讨视网膜神经细胞中Ku和BRCA1基因沉默的分子机制是否与其启动子的甲基化有关； 2.探讨视网膜神经细胞中Ku和BRCA1去甲基化后是否会影响其DNA修复能力。 研究方法： 1.原代培养SD乳鼠视网膜神经细胞，MAP2免疫荧光法鉴定神经细胞纯度。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(对照组不加5-Aza—CdR)处理，72小时后提取总RNA，RT—PCR检测5-Aza—CdR对Ku表达的影响。 2.原代培养SD乳鼠视网膜神经细胞，MAP2免疫荧光法鉴定神经细胞纯度。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(对照组不加5-Aza—CdR)处理，72小时后提取总蛋白检测Ku的表达。 3.原代培养纯化后的SD乳鼠视网膜神经节细胞。0.5μM，1.0μM，2.0μM5-Aza—CdR(对照组不加5-Aza—CdR)处理，72小时后倒置显微镜下进行拍照，比较不同组间神经节细胞突起长度的差异。 4.原代培养纯化后的SD乳鼠视网膜神经节细胞，5-Aza—CdR处理72小时，然后无血清培养6小时，再恢复完全培养液，提取DNA，检测DNA的完整性。 5.Real time PCR进一步检测5-Aza—CdR对原代培养纯化后的SD乳鼠视网膜神经节细胞BRCA1表达的影响。 6.提取原代培养视网膜神经节细胞的DNA通过甲基化敏感性限制性内切酶PCR法检测BRCA1启动子的甲基化情况。 结果： 1.原代培养SD乳鼠视网膜细胞，MAP2免疫荧光法鉴定神经细胞纯度，所培养视网膜细胞中，MAP2阳性细胞87％。 2.RT—PCR检测表明，5-Aza—CdR处理的视网膜神经细胞中，Ku的mRNA表达较对照组有明显增加。 3.Western Blot检测显示，5-Aza—CdR处理的视网膜神经细胞中Ku蛋白的表达较对照组有明显增加。 4.普通光镜下观察纯化后的SD乳鼠视网膜神经节细胞，经5-Aza—CdR处理组的轴突长度较对照组缩短。 5.DNA电泳结果显示，5-Aza—CdR促进视网膜神经节细胞DNA的修复，染色体DNA更完整，断裂的DNA较对照组明显减少。 6.Real time PCR检测显示，加入5-Aza—CdR处理的视网膜神经细胞节BRCA1mRNA的表达较对照组明显增加。 7.DNA酶切及PCR验证了视网膜神经节细胞BRCA1的启动子中两个HapⅡ的酶切位点发生了甲基化。 结论： 本研究证明：在终末分化视网膜神经细胞中Ku和BRCA1的沉默与其启动子甲基化有关，去甲基化可促进视网膜神经细胞DNA的损伤修复。