第一部分香草醛交联rhBMP-2/壳聚糖微球的制备及其对间充质干细胞的影响研究背景：RhBMP-2是一种重要的骨诱导活性蛋白,它在体内具有很强的诱导骨组织生成的能力。而既往的研究表明rhBMP-2在体内的释放模式对其诱导成骨的作用具有重要的影响,rhBMP-2早期的突释结合后期的持续释放较短时间大剂量释放能够更高效的诱导骨组织生成。壳聚糖是一种来源广泛的天然生物材料,具有良好的生物相容性,它可作为许多细胞因子的缓释载体。同时香草醛与传统的交联剂(戊二醛等)相比生物相容性更好。因此用香草醛为交联剂有可能制备出生物相容性更好,且具有良好缓释性能的rhBMP-2/壳聚糖微球。目的：以香草醛为交联剂来制备rhBMP-2/壳聚糖微球,明确该微球在体外rhBMP-2的缓释性能,并且明确微球缓释的rhBMP-2对骨髓间充质干细胞的影响。方法：利用乳化交联法来制备包载rhBMP-2的壳聚糖微球,用电镜观察微球的形态。以微球浸提液为实验组,以空白培养基为对照组来培养人间充质干细胞,以检测微球的细胞毒性和对细胞增殖的影响。用动态浸泡的方法来检测rhBMP-2的体外释放特征。通过比较缓释3天和7天获取的微球缓释液与空白培养基对细胞ALP表达的影响,来反应缓释的rhBMP-2是否具有生物活性。结果：所制备的壳聚糖微球呈球状。将微球浸提液与人间充质干细胞培养24及48小时,两个时间点实验组与对照组OD值无显著性差异(24h：0.719±0.072比0.726±0.051,p>0.05；48h：1.192±0.108比1.273±0.058,p>0.05)。将浸提液与细胞培养1、3和7天,实验组和对照组细胞数量均逐渐增多,且每个时间点实验组与对照组OD值无明显差异。5mg微球在体外释放19天,rhBMP-2逐渐释放,第19天检测浓度仍达到216.14±20. OOng/mL。缓释3天与7天组间充质干细胞ALP活性分别为：(0.504±0.065). (0.684±0.060)μmol pNPP/min/mg protein,均显著高于空白培养基组(0.135±0.011)(p<0.05)。结论：用香草醛为交联剂制备的rhBMP-2微球具有良好的生物相容性,能够达到缓释rhBMP-2的目的,且在制备过程中仍能保持rhBMP-2的生物活性。第二部分 胶原/rhBMP-2壳聚糖微球修饰的多孔HA支架的制备及体外生物相容性研究研究背景：随着快速成形技术的发展,目前许多材料可通过三维打印技术制备出个性化的骨修复材料,由于它是增材制造技术,因此能够实现对材料内部结构的精细控制。目前通过该技术可制备出内部孔隙高度贯通的骨修复支架,然而单纯依靠结构的改变很难实现大块骨修复材料内部骨组织的充分长入。因此良好的骨组织工程支架还需要具备一定的骨诱导活性。将骨诱导活性蛋白与多孔骨组织工程支架相结合,从而构建出同时具备骨诱导性和骨传导性的支架材料有可能成为大块骨缺损修复的良好选择。目的：通过三维打印技术制备多孔HA支架,并对支架进行胶原/rhBMP-2壳聚糖微球涂层修饰,从而构建出同时具备骨诱导活性和骨传导性的复合多孔HA支架,并且在体外验证复合支架的生物相容性。方法：用计算机建立多孔支架的三维模型,然后用挤压成形系统制备多孔HA支架,并进行微波热处理。分别对支架进行胶原涂层(HC)和胶原/rhBMP-2壳聚糖微球涂层(HCC)构建复合支架。用环境扫描电镜分别观察HA、HC及HCC支架的表面形貌。用人骨髓间充质干细胞来检测所合成支架的细胞毒性以及对细胞增殖的影响。将人骨髓间充质干细胞滴加到支架的表面,观察不同复合支架表面粘附细胞的差异。通过动态浸泡的方法来检测HCC支架中rhBMP-2体外释放的方式。将支架分别浸泡1、3和7天后,收集浸提液,检测浸提液中rhBMP-2对细胞ALP活性的影响,从而间接的反应复合材料中rhBMP-2的活性。结果：通过电镜观察结果显示3D打印的HA支架表面可形成胶原涂层,并且将rhBMP-2壳聚糖微球滴加到支架后,在支架的表面可见有微球的粘附,且部分微球发生团聚现象。支架浸提液细胞毒性实验结果显示所合成的支架在24小时和48小时两个时间点,HCC组浸提液细胞活性与HC、HA及空白组相比无明显差异。将细胞与支架混合培养1、3和7天结果显示各个时间点每组间细胞数量都逐渐增加,且在每个时间点各个组间细胞数量无明显差异。细胞粘附实验结果显示hMSCs可粘附于多孔支架表面,且HCC支架表面粘附的细胞数较其他组多。体外释放实验结果显示,HCC支架表面rhBMP-2的释放可持续3周以上,且每个时间点测得的rhBMP-2浓度都高于112.8ng/ml。ALP活性检测结果显示所释放的rhBMP-2仍可诱导hMSCs细胞ALP活性增加。结论：胶原/rhBMP-2壳聚糖微球涂层是将rhBMP-2与三维打印HA支架进行复合的良好方法,所构建的复合支架具有良好的生物相容性且能够长时间的缓释有活性的rhBMP-2。它在体外可以良好的支持人骨髓间充质干细胞的增殖和粘附。第三部分胶原/rhBMP-2壳聚糖修饰的多孔HA支架的体内诱导异位成骨研究研究背景：骨修复材料与宿主骨的紧密结合是防止内植物松动,移位或者疲劳性断裂的重要保证。单纯的多孔材料可通过调节材料的孔隙率或者表面改性增加细胞粘附等方式提高材料的骨传导性。然而对于大块骨修复材料,单纯依靠增加骨传导性来达到骨组织向材料内部生长的方法作用有限。如何让复合材料具备诱导组织细胞向成骨细胞分化,而实现自身诱导成骨的能力,是大块骨修复材料的研究热点。目的：比较单纯的HA支架、经胶原涂层的HC支架以及胶原/rhBMP-2壳聚糖微球修饰的多孔HCC支架在兔肌袋内的埋植后支架内部组织生长的差异。明确经rhBMP-2壳糖微球修饰的支架内部骨组织分布的情况。方法：用新西兰大白兔股四头肌肌袋作为异位成骨的模型。实验分3组：HA、HC及HCC组。于每只兔子右后肢作长lcm切口,并制备股四头肌肌袋模型,分别将支架埋入肌袋内,每组8只,于4周和8周时取出标本,用硬组织切片机制备组织切片,并用VG染色后观察组织生长情况。用micro-CT对标本进行扫描分析,明确骨组织生长情况。用mimics软件进行骨组织三维重建,观察所形成的骨组织大体观。结果：植入8周时组织样本的大体观可见,HCC支架表面的软组织较为致密且与材料粘附紧密,而HA及HC组周围的软组织较为疏松容易从支架上脱落。HCC支架micro-CT观察结果显示4周时骨体积分数为11.56%,而到了8周时则为17.14%。随着植入时间的延长,骨小梁的厚度(4周：0.074±0.05mm；8周：0.083±0.05mm)和骨量(4周：4.69±1.09mm3；8周：7.12±1.56mm3)都逐渐的增大。标本的硬组织切片观察结果显示HA及HC组支架内部主要由纤维组织和脂肪组织充填而无新生的骨组织,而HCC组支架的表面可见有新生的骨组织生成,且骨组织由内向外较均匀的粘附于支架的孔壁上,且4周较8周时骨小梁的厚度增加。三种支架孔隙内均可见到有新生的血管组织生成。结论：本研究所制备的胶原/rhBMP-2壳聚糖微球涂层支架可有效的在体内诱导骨组织生成,rhBMP-2壳聚糖微球缓释涂层是将骨诱导生长因子与骨组织工程支架相复合构建同时具备良好骨诱导性和骨传性复合人工支架的有良好方法。