重组人骨形态发生蛋白-2/珍珠层/聚乳酸羟基乙酸支架修复大鼠颅骨缺损的实验研究

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目的:制备珍珠层/聚乳酸羟基乙酸(Poly-lactide-co-glycolic acid,PLGA)支架,并负载重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant Human Bone MorphogeneticProtein-2,rhBMP-2),探讨其体外和体内的生物相容性以及成骨活性。方法:1.采用相分离/盐析复合工艺将珍珠层粉、聚乳酸羟基乙酸(PLGA)按不同比例复合,制备珍珠层/PLGA支架,检测珍珠层与PLGA以不同比例合成的支架形貌、孔隙率、亲水性、生物力学强度,选取力学性能较好的支架加载rhBMP-2,并测试rhBMP-2的体外释放特征。2.采用CCK-8法检测材料浸提液对MC3T3-E1细胞增殖的影响,计算细胞相对增值率;电镜扫描细胞在材料表面的粘附生长情况;荧光显微镜观察细胞在材料内部的生长情况;材料浸提液诱导MC3T3细胞分化为成骨细胞并产生矿化结节,用IPP软件对钙结节面积进行计算。并与珍珠层/PLGA组比较。将材料植入新西兰兔皮下,取1周,4周的组织行HE切片,检测其炎症反应,HE染色观察是否有异位成骨,并与珍珠层/PLGA比较。3.建立大鼠颅骨5mm临界骨缺损模型。将材料植入大鼠颅骨缺损区,于第6和12周用CBCT检测材料对缺损区修复程度;扫描电镜观察材料与边界结合界面;穿透实验检测材料6周和12周时的材料与骨的结合能力;HE染色检测材料的成骨情况,并与珍珠层/PLGA组修复效果进行比较。结果:1.采用相分离/盐析法制备的珍珠层/PLGA支架,呈三维多孔状结构,大孔孔径150~250μm,小孔孔径10~30μm,孔隙率均大于86%,各组间无统计学差异。珍珠层/PLGA质量比1:1,3:2,2:1三组与纯PLGA组亲水性有统计学差异(P<0.05),但三组间无统计学差异(P>0.05)。珍珠层/PLGA为3/2组具有较好的力学强度,该组分材料压缩强度3.8718±0.1981MPa、弯曲强度15.7334±1.0198MPa、拉伸强度4.0468±0.0894MPa。珍珠层/PLGA为3/2组负载的rhBMP-2在前7天存在突释,7天后释放趋于平缓。2. rhBMP-2/珍珠层/PLGA材料在1,3,5,7天相对增值率均大于92%,细胞毒性1级,细胞在材料表面及内部均生长良好,材料浸提液能加速诱导MC3T3-E1细胞分化,产生矿化结节面积经茜素红染色后优于珍珠层/PLGA组,两组间存在统计学差异(P<0.05)。HE染色见两组材料1周时均见轻度炎症反应,4周时均无明显炎症,可见异位成骨。3.在SD大鼠颅骨双侧可建立5mm临界骨缺损模型。电镜下rhBMP-2/珍珠层/PLGA组与自体骨结合紧密程度优于珍珠层/PLGA组,rhBMP-2/珍珠层/PLGA组承受穿透强度能力第6周和12周均优于珍珠层/PLGA组,两组间存在统计学差异(P<0.05)。HE切片可见实验组植入缺损区6周时,有较多新骨长入支架孔隙;12周时,材料和宿主骨融为一体,成骨效果优于珍珠层/PLGA组。结论:相分离/盐析法合成的rhBMP-2/珍珠层/PLGA支架具有良好的生物学性能和生物相容性,能有效修复大鼠颅骨缺损,具有潜在的骨组织工程应用前景。
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