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上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是多细胞生物器官形成的基本过程。近来发现，这一过程和许多疾病存在联系，包括各种纤维化疾病及恶性肿瘤的发生、发展。最初在上皮类型细胞系中进行的关于EMT发生机制的研究表明：在上皮极性消失及间质特性获得的过程中，有多种信号传导通路的参与。上皮型细胞转化为间质型细胞，其表型发生变化、细胞结构发生改变、细胞间黏附力下降及细胞迁徙能力增强。通常用来验证EMT过程发生的分子学标志物包括：间质型标记基因N-cadherin和Vimentin表达的增加、β-catenin的核内转移，以及上皮型标志基因E-cadherin和Cytokeratin的表达下降。核转录因子-κB(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)在多种人类肿瘤中高表达，不同的NF-κB家族成员可以结合成不同的二聚体。在这些二聚体中，最常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体。NF-κB的激活在细胞生存、粘附、分化和细胞生长中起关键作用，有研究显示，在一些人类肿瘤，如肝癌、肠癌和宫颈癌中NF-κB信号通路的激活在肿瘤的发生中起着重要作用。研究表明：在乳腺上皮细胞中诱导EMT发生时，NF-κB是必须的。细胞丧失NF-κB活性后将无法逃避TGF-β诱导的凋亡，且EMT相关基因的表达亦受到抑制，从而阻断EMT过程。相反，激活此通路可以在缺乏TGF-β的情况下促使细胞向间叶细胞形态的转化。此外，在间质表型的细胞中抑制NF-κB的活性可以导致EMT过程的逆转，提示NF-κB对诱导和维持EMT是必须的。食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，尤其在中国河南的林县，食管癌的发生率和死亡率均较高。本实验为了证实食管鳞癌发生、发展过程中发生了EMT，检测了100例食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞系EC9706中E-cadherin和Vimentin的蛋白表达情况。并且，以EC9706为对象，采用阳离子聚合物介导的反义寡核苷酸(ASODN)技术，特异性地抑制NF-κB p65亚单位，研究NF-κBp65受到抑制前后，细胞内E-cadherin和Vimentin的表达情况，探讨NF-κB与食管鳞癌中EMT的关系，以及NF-κBp65 ASODN对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、周期及迁徙能力的影响，探讨NF-κB信号通路能否成为食管鳞癌治疗的靶点，为食管癌的基因治疗提供理论基础。材料和方法：1．采用免疫组织化学技术(IHC)检测100例食管鳞癌组织及食管正常鳞状上皮中E-cadherin及Vimentin蛋白的表达情况。2．采用RT-PCR方法和免疫细胞化学(ICC)、流式细胞术(FCM)检测食管鳞癌细胞系EC9706中NF-κBp65、E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白的表达情况。3．针对NF-κBp65转录启动区的寡核苷酸序列设计合成反义寡核苷酸(ASODN)、正义寡核苷酸(SODN)和一条无关序列寡核苷酸(NSODN)。采用阳离子聚合物介导的寡核苷酸转染技术转染食管鳞癌细胞EC9706。3．1观察NF-κBp65 ASODN对EC9706细胞形态的影响。3．2采用RT-PCR方法、免疫细胞化学和流式细胞术观察转染NF-κBp65 ASODN的EC9706与对照组相比，NF-κBp65 mRNA及蛋白表达的变化。3．3采用RT-PCR方法、免疫细胞化学方法和流式细胞术观察NF-κBp65 ASODN对EC9706细胞中E-cadherin与Vimentin mRNA及蛋白表达的影响。3．4采用细胞划痕实验检测NF-κBp65 ASODN对EC9706细胞迁移能力的影响。4．采用流式细胞术检测NF-κBp65 ASODN对EC9706凋亡及细胞周期的影响；MTT法检测转染后各组EC9706细胞的增殖情况，。5．统计学处理：所有数据均经SPSS13.0软件进行统计分析。计数资料计算阳性率，计量资料采用(?)±s表示；阳性率之间的比较采用χ~2检验(chi-square)；两组均数的比较用t检验(t-test)，两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)；阳性率之间的相关性采用Kendall相关分析进行比较。显著性水准α=0.05。结果1．E-cadherin蛋白在食管癌中的表达(43％)明显低于食管正常粘膜中的表达(85％)(P＜0.01)，Vimentin蛋白在食管癌中的表达(23％)明显高于食管正常粘膜中的表达(0％)(P＜0.05)，两者的表达呈负相关关系，相关系数T_b=-0.379。2．RT-PCR法、免疫细胞化学和流式细胞术结果显示：EC9706细胞中，NF-κBp65在mRNA(0.448±0.045)和蛋白水平(ICC：17.15±1.78％；FCM：15.76％)均有表达；E-cadherin在mRNA(0.218±0.065)和蛋白水平(ICC：14.44±1.65％；FCM：12.22％)有表达；Vimentin在mRNA(0.893±0.089)和蛋白水平(ICC：19.52±1.07％；FCM：17.76％)有表达。3．转染72h后，RT-PCR表明：转染NF-κBp65 ASODN的细胞组中NF-κBp65 mRNA的表达水平(0.135±0.060)明显低于EC9706对照组(0.448±0.045)(P＜0.01)。免疫细胞化学结果表明NF-κBp65阳性细胞数量(11.35±1.32％)较EC9706对照组(17.15±1.78％)减少(P＜0.01)，细胞浆着色减弱。流式细胞术检测结果显示：转染NF-κBp65 ASODN的EC9706细胞中p65蛋白阳性表达率(11.78％)明显低于其在EC9706对照组(15.76％)中的表达(P＜0.01)。4．ASODN转染组EC9706细胞E-cadherin mRNA的表达(0.360±0.084)明显高于EC9706对照组(0.218±0.065)(P＜0.01)，而Vimentin mRNA的表达(0.753±0.066)明显低于EC9706对照组(0.893±0.089)(P＜0.01)。免疫细胞化学结果显示：反义组中E-cadherin的表达率(16.21±2.64％)较EC9706对照组(14.44±1.65％)上调(P＜0.05)；Vimentin的表达率(17.33±1.76％)较EC9706对照组(19.52±1.07％)下调(P＜0.01)。流式细胞术检测转染后的EC9706细胞内E-cadherin及Vimentin蛋白的表达，反义组中E-cadherin的表达(14.98％)高于对照组(12.22％)(P＜0.05)，而Vimentin的表达(12.90％)则比对照组(17.76％)显著性降低(P＜0.01)。5．与对照组相比，转染NF-κBp65 ASODN的EC9706细胞的相对迁移距离在48h(0.32±0.06)、72h(0.45±0.08)均较EC9706对照组(48h：0.69±0.12，72h：0.81±0.11)显著减弱(P＜0.01)。6．流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的情况，结果表明：反义组细胞凋亡百分率(1.38％)较EC9706对照组(0.96％)显著性升高(P＜0.01)；反义组G1期的细胞数(78.5％)较EC9706对照组(66.5％)高(P＜0.01)，S期细胞数(12.2％)较EC9706对照组低(23.7％)(P＜0.01)。MTT结果显示：NF-κBp65 ASODN转染组细胞(48h：0.34±0.04；72h：0.45±0.09)较EC9706对照组(48h：0.38±0.04；72h：0.53±0.09)增殖减慢(P＜0.05)。结论：1．食管癌组织中存在上皮性标志物E-cadherin的表达下调及间质性标志物Vimentin的表达上调，两者呈负相关关系。提示在食管癌发生、发展过程中可能存在上皮-间质转化(EMT)。2．NF-κBp65 ASODN可以特异性抑制细胞内NF-κBp65 mRNA及蛋白的表达。3．转染NF-κBp65 ASODN 72h的EC9706细胞中，E-cadherin mRNA及蛋白表达明显上调；而Vimentin mRNA及蛋白表达明显降低；且细胞迁移运动能力明显降低，提示NF-κBp65可能参与了食管鳞癌细胞的EMT过程，为NF-κB信号通路成为食管鳞癌基因治疗靶点提供实验基础。4．NF-κBp65 ASODN可以有效阻断食管鳞癌细胞系EC9706中NF-κB信号通路，明显抑制细胞的生长，促进其凋亡。