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研究目的甲基叔丁基醚(Methyl Tert-Butyl Ether,MTBE)是一种新型的汽油添加剂,主要用来增加汽油辛烷值,提高汽油燃烧效率,减少汽车尾气中一氧化碳等有害物质的排放,并代替四乙基铅用作汽油防爆剂。从1992年冬季开始,美国市场上已有大约30%的汽油含MTBE(高达15%),我国目前有31家炼油厂建有MTBE生产装置,已开工的企业16家。随着无铅汽油的推广,MTBE在我国的大规模生产和使用已是必然。由于汽油泄露,美国的一些饮用水源中已检测到MTBE的存在。鉴于空气、水和土壤中MTBE的存在,开展MTBE无铅汽油的毒性研究,对保护使用者的身体健康及未来环境污染的治理都具有深远的意义。实验研究发现MTBE对神经系统有较高的亲和力及损伤作用;调查研究发现,在使用含MTBE的无铅汽油后,一些地区的居民出现散在的健康主诉包括头痛、头晕、恶心、耳鸣、疲劳、记忆力减退、睡眠甚至认知障碍等神经系统症状。目前对MTBE损伤中枢神经系统(CNS)的机制尚不清楚,对MTBE的生物危害仍无可靠的评价依据和方法,因此研究MTBE损伤CNS的生物效应,阐明MTBE损伤CNS的可能作用机制,是目前亟需解决的重要问题。学习记忆功能作为脑的高级功能,是非常复杂和精细的神经活动,是评价中枢神经系统功能的重要内容。从对学习记忆功能影响的角度探讨MTBE对中枢神经系统的损伤及其机制,可以深入的了解MTBE对CNS的毒性机理,客观评价其毒性作用,为有效预防MTBE神经毒性作用提供科学依据。实验方法利用雄性SD大鼠建立动物染毒模型,从灌胃染毒、呼吸道吸入染毒到脑室注射染毒中寻找相对合理及实用的染毒方法,最终确立以侧脑室注射建立MTBE影响学习记忆的动物模型,利用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力的变化;尼氏染色观察MTBE对大鼠海马神经元形态结构的影响; RT-PCR法检测海马中GABAARα1及NMDAR2A&2B转录水平的变化;免疫组织化学法检测海马GABAAα1及NMDAR2A&2B蛋白表达变化;Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导通路中一些蛋白分子及其磷酸化水平变化;TUNEL染色观察大鼠海马神经元的凋亡。实验结果1、从灌胃染毒后第6天起染毒组大鼠体重较对照组明显下降,且体重增长率随时间延长而逐渐降低;Morris水迷宫实验结果显示:灌胃染毒MTBE对大鼠学习记忆能力未产生明显影响;脑片尼氏染色显示染毒组海马CA1区尼氏小体较对照组排列紊乱,空泡增多。2、呼吸道及灌胃染毒后利用气相色谱在脑脊液中可检测到MTBE及其代谢产物的存在。3、侧脑室注射MTBE可以使大鼠的学习能力下降,记忆时间延长。空间定位能力有所下降,记忆提呈的反应时间增加。3.1尼氏染色发现大鼠海马部位尼氏小体排列紊乱,结构变形,空泡形成; RT-PCR、免疫组织化学结果显示:不同剂量MTBE染毒组海马GABAARα1 mRNA及蛋白水平较对照组逐渐增高,NMDAR2A mRNA及蛋白表达水平较对照组逐渐降低;MTBE作用不同时间结果显示:大鼠海马GABAARα1 mRNA于术后3 h逐渐降低,至24h左右恢复至正常水平后又逐渐升高,后一直保持较高的转录水平;NMDAR2A mRNA水平于3 h较对照组降低,于术后6 h逐渐升高,于24 h逐渐降低,7d组mRNA水平明显低于对照组(P<0.05);NMDAR2B mRNA水平于术后降低,12 h左右恢复至正常水平;水迷宫结果显示:MTBE染毒并注射GABAAR激动剂muscimol组大鼠学习记忆能力进一步降低,而MTBE染毒并注射GABAAR拮抗剂bicuculline提高大鼠的学习记忆能力。3.2 TUNEL染色结果显示:MTBE可以诱导海马神经元细胞凋亡增加;Western blot结果显示:术后各组大鼠海马p-ERK1/2水平于术后12 h逐渐升高,然后逐渐下降,术后第5d和7d低于对照组水平(P<0.05),高剂量组下降幅度大于低剂量组。随作用时间不同,p-JNK1/2水平逐渐升高,至12 h时达到峰值(P<0.05),然后逐渐缓慢下降,但直到7 d时仍显著高于对照组水平(P<0.05);pp38水平在染毒后3 h下降,然后逐渐增高,并高于对照组水平,至5 d时达到峰值(P<0.05),直到7 d时仍显著高于对照组水平,高剂量组增高幅度大于低剂量组。结论1.通过灌胃及呼吸道亚急性暴露,MTBE可以通过血脑屏障;2.侧脑室注射MTBE可以导致大鼠学习记忆能力的下降;3. MTBE对大鼠学习记忆能力的损伤可能涉及GABAAR和NMDAR功能的变化,这种变化可能与GABAARα1 mRNA及蛋白表达水平的增加,NMDAR2A mRNA及蛋白表达水平的降低有关;4.诱导海马神经元凋亡可能是MTBE引起大鼠学习记忆能力损伤的原因之一,其分子机制可能与JNK、p38磷酸化水平的增高,ERK磷酸化水平的下降相关。