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虫草Cordyceps中不少种类具有多种药用价值,已报道了500多种,但真正实现产业化生产子实体的虫草并不多见,仅见蛹虫草C.militaris,积极研究开发新的野生虫草资源显得十分必要。本研究对一种新的野生虫草进行了分离鉴定,并进行了相关的培养特性研究、有效成分分析及食用安全性评价。
1.广东虫草的分离与鉴定
在广东阳春市采集获得一种野生虫草(GDGM24020、GDGM24851),通过形态学鉴定,该虫草子实体的形状、大小和颜色等特征与日本虫C.japonica Lloyd较为接近,但子囊壳和次生子囊孢子较日本虫草C.japonica小。通过rDNA内转录间隔区(ITS)序列进化分析,同样显示该虫草与日本虫草C.japonica最为接近,但它们的序列相似率仅有93.9%;随机扩增多态性DNA(RAPD)分析也证实了该虫草与日本虫草C.japonica有明显差异。因此,该野生虫草被鉴定为新种,定名为广东虫草Cordyceps guangdongensis T.H. Li,Q.Y Lin& B.Song。
以野外收集的新鲜子实体为材料,通过组织分离和多孢分离的方法获得了广东虫草C.guangdongensis的无性型。通过培养特性和形态特征观察,发现该无性型的特征符合枝顶孢属的定义特征,即分生孢子梗直立,不分枝,直接单长在菌丝细胞上,有隔膜,分生孢子单细胞,椭圆形,无色,大小为5.4-7.4μm×3.9-4.9μm,常聚成头状,外包有粘液。然而,该无性型的分生孢子大小及其他的一些特征组合与该属中已报道的种类均有所不同,被鉴定为一新种,命名为广东枝顶孢Acremonium guangdongensis T.H. Li,Q.Y Lin& B.Song。以诱导子实体形成的方式确定了该无性型是广东虫草C.guangdongensis的无性型。
2.广东虫草的生物学研究
通过单因素比较试验,确定了广东虫草C.guangdongensis液体培养的最佳条件。菌丝体生长的最佳接种量为8%(v/v),最适温度为25℃,最佳pH为9.0,最佳转速为200 rpm,最佳碳源、氮源和碳氮比分别为麦芽浸出物、黄豆粉和12:1。产生胞外多糖的最佳接种量为15%(v/v),最佳温度为25℃,最佳pH为7.0,最佳转速是150 rpm,最佳碳源、氮源和碳氮比分别是葡萄糖、酵母浸膏和12:1。发现K对菌丝的生长有促进作用,P、S和Ca有利于胞外多糖的形成。经正交试验优化,菌丝体生长的最佳培养基组成如下:麦芽浸出物30 g/L、葡萄糖10 g/L、黄豆粉10 g/L、酵母浸膏4 g/L,pH9.0;产生胞外多糖的最佳培养基为:麦芽浸出物30 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸膏10 g/L,pH7.0。菌丝体和胞外多糖的产量分别为14.12 g/L和1.69 g/L。
广东虫草C.guangdongensis子实体的生物学研究结果显示:该虫草子实体生长的最佳起始pH为6.0;最佳生长温度23℃下,菌丝生长6-10 d进入光敏期,是诱导原基的最佳时期,光照强度800-1000 Lx时,原基形成的数量最多;子实体生长阶段要求光照强度在500 Lx以下,强度越低越利于子实体的生长,过高的光照强度会加快广东虫草C.guangdongensis子实体老化,缩短成熟周期。在营养要求方面,广东虫草C.guangdongensis生长的最佳碳源、氮源和碳氮比分别是蔗糖、KN03和12:1;K、H3BO3、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O和Na2MoO4·2H2O对子实体的产量有明显的促进作用;培养基含水量为63%时,子实体产量最高。经优化,广东虫草C.guangdongensis最佳栽培培养基组成为:蔗糖20 g/L、黄豆4 g/L、牛肉浸膏5 g/L、KNO310 g/L。广东虫草C.guangdongensis的生长周期约为60 d。
3.广东虫草的有效成分及安全性评价
广东虫草C.guangdongensis子实体的成分研究表明,其虫草酸含量高达392mg/g、虫草素为0.81 mg/g,腺苷为0.015 mg/g、粗多糖为0.96%,16种水解氨基酸总量为15%、粗蛋白含量达27.5%,灰分为3.5%,维生素B1和B2分别为16.4μg/g和9.6μg/g,并含有多种微量元素如Fe、Cu和Zn等。广东虫草C。guangdongensis的重金属Hg.Pb和As含量分别低于0.1μg/9、0.5μg/g和0.5μg/g,符合国家食用菌质量安全要求。
经小鼠急性经口毒理试验显示:广东虫草C.guangdongensis属无毒级物质,经口LD50大于15.0g/kg体重。