【摘 要】
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目的:（1）建立止得咳颗粒HPLC指纹图谱。（2）考察止得咳颗粒的抗炎作用及其可能机制。（3）研究止得咳颗粒HPLC指纹图谱与抗炎作用的谱效关系,初步探索其抗炎药效物质基础。（4）建立HPLC同时测定止得咳颗粒中次野鸢尾黄素、黄芩苷2种成分的含量测定方法;建立HPLC测定止得咳颗粒中连翘酯苷A含量的方法。（5）初步考察止得咳颗粒的稳定性。方法:（1）采用HPLC测定10批止得咳颗粒样品指纹图谱,计
【基金项目】
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广西创新驱动发展专项资金资助项目（桂科AA17202046）； 广西中医药大学校级一般硕士研究生科研创新项目（YCSY20190081）；
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目的:（1）建立止得咳颗粒HPLC指纹图谱。（2）考察止得咳颗粒的抗炎作用及其可能机制。（3）研究止得咳颗粒HPLC指纹图谱与抗炎作用的谱效关系,初步探索其抗炎药效物质基础。（4）建立HPLC同时测定止得咳颗粒中次野鸢尾黄素、黄芩苷2种成分的含量测定方法;建立HPLC测定止得咳颗粒中连翘酯苷A含量的方法。（5）初步考察止得咳颗粒的稳定性。方法:（1）采用HPLC测定10批止得咳颗粒样品指纹图谱,计算其相似度（SA）,综合应用聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）对其进行质量评价,分析原料药材-中间体-成品指纹图谱的相关性,并对色谱峰进行归属。（2）采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、小鼠棉球肉芽肿模型,检测棉球肉芽肿小鼠血清中白介素-1β（1L-1β）、白介素-6（1L-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的含量和肝组织匀浆中谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）的含量,考察止得咳颗粒的抗炎作用和可能机制。（3）通过偏最小二乘法（PLS）将10批止得咳颗粒指纹图谱共有峰与二甲苯致小鼠耳廓肿胀和小鼠棉球肉芽肿的抑制率进行关联性分析,筛选出对抗炎药效作用贡献较大的色谱峰。（4）止得咳颗粒中次野鸢尾黄素、黄芩苷含量测定方法采用的色谱柱为Phenomenex Kinetex XB-C18（4.6×250 mm,5μm）,流动相为甲醇-0.2%磷酸（55:45）,流速为0.8 m L/min,检测波长为266 nm,柱温为30℃。利用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术,在线测定止得咳颗粒中的单个成分获得其准分子离子及二级碎片离子,结合文献报道进行初步鉴定;通过HPLC进行对照品验证并测定该成分含量。（5）采用加速试验和长期试验研究止得咳颗粒三批中试样品的稳定性。结果:（1）10批止得咳颗粒样品HPLC指纹图谱标定了31个共有峰,通过对照品指认了4个成分,10批止得咳颗粒样品之间的相似度均在0.977以上;聚类分析结果为当欧氏距离为10～15时,10批止得咳颗粒样品可以聚为3类;主成分分析降维提取了5个主成分,反映了原变量93.3%的信息,PCA得分将10批样品分为3类,与聚类分析结果一致。结合正交偏最小二乘法-判别分析发现15个成分是造成不同批次样品差异性的主要标记物;中间体提取物的主要成分均保留在成品中,色谱峰主要来自黄芩、射干、龙脷叶、青天葵、枇杷叶、柴胡药味。（2）止得咳颗粒对二甲苯致小鼠耳廓肿胀和棉球植入致小鼠肉芽肿均有抑制作用（P＜0.05,P＜0.01）,能显著降低棉球肉芽肿小鼠血清中1L-1β（P＜0.01）,1L-6（P＜0.01）,TNF-α（P＜0.01）,PGE2（P＜0.05）水平,显著提高棉球肉芽肿小鼠肝组织匀浆中GSH-Px（P＜0.05）,T-SOD（P＜0.05）的活性,降低MDA（P＜0.05）的含量。（3）10批止得咳颗粒均可显著性降低小鼠耳廓肿胀和小鼠棉球肉芽肿（P＜0.05,P＜0.01）,PLS分析结果显示,止得咳颗粒HPLC指纹图谱31个共有峰中与小鼠耳廓肿胀抑制率呈正相关作用的有15个色谱峰,与小鼠棉球肉芽肿抑制率呈正相关作用的有15个色谱峰,其中发挥抗炎作用贡献最大的为3,6,19,27,28（次野鸢尾黄素）,29,30（汉黄芩素）号色谱峰,这些色谱峰主要来自黄芩、射干药味。（4）建立了HPLC同时测定止得咳颗粒中次野鸢尾黄素、黄芩苷含量的方法,其线性范围分别在1.69～16.92μg/m L（r=0.9995）,0.0448～0.56 mg/m L（r=0.9999）峰面积和浓度呈优良的线性关系;平均加样回收率（n=6）分别为102.04%,101.47%,RSD分别为2.35%,1.48%,表明结果可靠。通过UPLC-Q-TOF/MS技术结合文献报道鉴定止得咳颗粒中含有连翘酯苷A,建立了HPLC测定止得咳颗粒中连翘酯苷A含量的方法。其线性范围在0.0237～0.2368 mg/m L（r=0.9997）峰面积和浓度呈优良的线性关系;平均加样回收率（n=6）为99.16%,RSD为2.81%。（5）三批中试产品在稳定性试验时间内质量稳定,性状、鉴别、检查、含量测定结果均符合要求。结论:HPLC指纹图谱结合化学模式识别方法可为系统评价止得咳颗粒整体质量提供参考。止得咳颗粒对小鼠急、慢性炎症反应有一定的抑制作用,作用机制可能与抑制炎症介质产生和抗氧化作用有关,且止得咳颗粒的抗炎作用是多种成分共同作用的结果,射干、黄芩药味对其发挥抗炎作用具有显著意义。所建立的含量测定方法稳定可行,为止得咳颗粒的质量控制提供理论基础。本论文通过研究止得咳颗粒的HPLC指纹图谱溯源性与抗炎药效物质基础、含量测定方法、制剂稳定性,可为止得咳颗粒临床应用的安全性、有效性和可控性奠定基础。
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