研究背景:自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一组较为严重的发育障碍性疾病,包括自闭症、阿斯伯格综合症、儿童期崩解障碍和未分类的广泛性发育障碍。自闭症临床表现的主要的特征包括:社交障碍,刻板重复行为模式和兴趣爱好缺乏。自闭症的发病原因非常复杂,目前的研究认为主要包括两方面的因素:环境因素和遗传因素。已经明确的与自闭症发生相关的致病基因已达上千个,而这些基因如何与环境因素相互作用导致自闭症的病理发生,目前仍不明确。近年的研究结果显示神经发生缺陷可导致自闭症的发生。在哺乳动物的整个生命周期中,神经发生活跃的区域主要集中于脑的室下区（Subventricular Zone,SVZ）和海马齿状回的颗粒下区（Subgranular Zone,SGZ）。这些区域神经发生出现异常,将影响大脑功能并导致神经精神疾病的发生。海马与学习记忆等脑的高级认知功能密切相关,对情绪的调节亦有重要作用。海马神经发生的异常与阿尔茨海默病等引起的认知功能障碍密切相关,并可能参与焦虑和抑郁样行为的发生。自闭症的病理改变发生在中枢神经系统多个脑区,海马是主要受累及的脑区之一。临床研究表明,自闭症患者的海马齿状回和CA4区的解剖结构明显异于常人。与健康对照组相比,12至18岁的自闭症青少年有更大的杏仁核和海马体。尸检发现,自闭症患者大脑的多个区域出现神经元迁移、成熟和神经发生（包括齿状回）异常。这些神经发育障碍的病理改变已经在多种自闭症小鼠模型中被证实。值得注意的是:海马齿回颗粒下区持续产生的新生神经元,能够整合入功能环路中,从而提供了功能修复和重建的重要途径。已经证实促进海马神经发生能够增强学习记忆等认知功能,并改善焦虑和抑郁样行为。阐明神经发生异常参与自闭症发生的途径与机制,有助于解析自闭症的病理发生机制;基于海马齿回具有极强的可塑性,亦为自闭症的干预治疗提供新策略。肝X受体（liver x receptors,LXRs）属于配体依赖的核转录因子超家族成员,在脂质稳态和代谢、炎症反应的调节中发挥关键作用。LXRs主要包括LXR?和LXRβ两个亚型,其中LXR?主要在脂质代谢相关的器官表达,而LXRβ具有较广泛的表达,为脑内占优势分布的主要受体,而且在中枢神经系统板层结构的发育过程中起着重要作用。课题组前期研究发现,LXRβ在大脑皮质、小脑皮质和脊髓灰质等板层样结构的形成中发挥重要作用。LXRβ缺失可导致大脑皮质板层变薄以及神经元的迁移、分化和成熟障碍;小脑浦肯野细胞发育障碍和颗粒神经元的迁移受阻;脊髓灰质中间神经元的发育与成熟障碍。LXRβ对板层结构的影响主要是通过调节放射状胶质细胞（radial glia cells,RGCs）来实现。我们的另一研究表明,LXRβ通过影响RGC向少突胶质前体细胞分化而参与脑白质发育和中枢神经系统髓鞘的形成,LXRβ缺失导致小鼠出现运动功能异常。海马齿回具有典型的板层样结构,在齿回的形成过程中RGC早期介导神经前体细胞和神经元的产生及向齿回的迁移,后期负责齿回颗粒细胞层及颗粒下区的形成。生后及成年海马齿回颗粒下区保留的神经前体细胞即由早期的RGC分化迁移而来,使海马终生具有神经发生的潜力。基于LXRβ对RGC发育及分化的重要调控作用,可以推测LXRβ致力于海马齿回的板层发育,然而其调控途径与机制目前尚未见报道。在本研究中,我们首次发现LXRβ缺失可以导致小鼠海马早期发育障碍,影响RGC的产生与分化成熟;在成年LXRβ敲除小鼠出现自闭症样行为改变。采用LXR激动剂TO901317激活LXRβ受体可显著缓解自闭症模型小鼠的社交行为缺陷并减少刻板重复行为,并在一定程度上修复了海马神经发育缺陷。研究方法与结果:1.肝脏X受体β调控小鼠早期海马齿状回发育的机制研究（1）检测E15.5和E18.5小鼠海马内BLBP标记的RGC,发现E15.5野生小鼠BLBP标记的RGC细胞富集在海马伞齿状回连接处（fimbriodentate junction,FDJ）,LXRβ缺失显著减少FDJ的RGC细胞;E18.5野生小鼠海马齿回内可见BLBP阳性细胞主要位于海马裂,并可观察到跨门区的丰富的BLBP阳性细胞迁移流,而LXRβ缺失则引起小鼠海马裂BLBP阳性细胞数减少,跨门区的BLBP阳性细胞迁移流表达减弱;Ki67免疫荧光显示,LXRβ缺失引起齿回增殖细胞减少。BrdU标记的显示,LXRβ缺失引起神经前体细胞从VZ向DG的迁移受到阻滞;GFAP免疫荧光染色标记P2小鼠海马齿回内RGC富集的瞬时神经发生区（transient neurogenic region,SPZ）,LXRβ缺失引起小鼠海马齿回SPZ区域减小,RGC数量显著减少;采用Tbr2标记海马齿回中间神经前体细胞,发现LXRβ缺失引起P2与P7齿回内Tbr2免疫阳性细胞数量减少,并且在P7时大量的Tbr2免疫阳性细胞滞留在分子层;用Prox1特异性标记海马齿回颗粒神经元,发现LXRβ缺失显著减少P2时小鼠海马齿回内Prox1标记的颗粒神经元数量。（2）小鼠P5、P6腹腔注射BrdU,P14收集脑组织样本,用BrdU、GFAP和Prox1进行免疫荧光染色,对海马齿回内神经前体细胞的分化进行分析,发现LXRβ缺失抑制小鼠海马齿回神经前体细胞向颗粒神经元分化,并促进其向星形胶质细胞分化。（3）采用WB技术检测P7时LXRβ对海马内Smad4、Reelin、P27^kip1、pERK1/2和ERK1/2等信号通路的调控作用,发现LXRβ缺失对海马内Smad4、Reelin、P27^kip1、pERK1/2和ERK1/2的表达无显著影响。Notch1免疫荧光染色,发现野生小鼠齿状回Notch1表达较多,而LXRβ敲除小鼠海马中Notch1表达显著减少。用WB技术检测Jagged1、NICD、BLBP和Hes1的表达,发现它们均在LXRβ敲除小鼠海马中表达量降低。野生小鼠腹腔同时注射Notch1的阻断剂DAPT和TO901317,结果显示TO901317的促海马神经发生作用被DAPT所抑制。2.肝脏X受体β缺失导致小鼠自闭症样行为（1）对小鼠进行三箱社交实验,在实验的第二阶段中发现野生小鼠对陌生小鼠的探索时间显著多于对物体的探索时间,而LXRβ敲除小鼠探索陌生小鼠和新物体的时间无明显差异;在三箱社交实验的第三阶段中发现,野生小鼠对陌生小鼠的探索时间显著多于对熟悉小鼠的探索时间,而LXRβ敲除小鼠探索野生小鼠和熟悉小鼠的时间则无明显差异。（2）Morris水迷宫实验检测发现,在训练阶段（第1-5天）,LXRβ敲除小鼠与野生小鼠找到平台的时间没有明显差异,在检测期（第6天）,两组小鼠在穿越平台次数上也没有明显差异;逆向水迷宫检测结果显示,LXRβ敲除小鼠较野生小鼠需要更长的时间找到平台。理毛实验结果显示,LXRβ敲除小鼠比野生小鼠的理毛时间明显增加。（3）新物体识别和位置识别实验结果显示,LXRβ敲除小鼠在识别系数上与野生组小鼠无显著差异。悬尾和强迫游泳实验结果显示,LXRβ敲除小鼠与野生小鼠在不动时间上无差异。嗅觉实验结果显示,LXRβ敲除小鼠与野生小鼠在找到食物的时间上没有明显差异。3.肝脏X受体β缺失对于小鼠海马基因表达的影响（1）对送检的RNA样本进行质量分析,样本均达到检测标准。（2）对芯片结果进行分析,LXRβ敲除导致小鼠海马出现717个差异表达基因,将这些差异表达基因与自闭症相关基因数据库进行比对,找到了19个相关基因;应用QPCR技术对其中的8个基因进行验证,其中6个基因的一致性较好。（3）差异表达基因的GO分析显示,LXRβ敲除可导致小鼠海马内与免疫相关的基因上调,而与脂质代谢相关的基因下调。（4）差异表达基因的pathway分析显示,LXRβ敲除可以引起细胞黏附分子相关的通路上调,而与类固醇合成的信号通路下调。4.肝脏X受体激动剂可以改善自闭症模型小鼠的社交缺陷和刻板重复行为（1）小鼠腹腔注射TO,对海马中LXRα的表达量没有影响,而显著升高海马内LXRβ及其靶基因ABCA1和ABCG1的表达量。（2）三箱社交实验发现,野生小鼠花更多的时间探索陌生小鼠,而BTBR小鼠探索陌生小鼠和物体的时间没有显著差异;TO注射后,野生小鼠的社交没有受到影响,但BTBR小鼠探索陌生小鼠的时间明显增加,具有显著差异。在理毛实验中发现,BTBR小鼠原本比野生小鼠花更多时间进行理毛,但经TO处理后,BTBR小鼠的理毛时间显著降低。（3）在社交实验中,经过TO注射后,VPA暴露模型小鼠花更多时间探索陌生小鼠,说明TO注射可以改善VPA暴露小鼠的社交能力。社交新奇性偏好实验结果显示,TO处理后VPA暴露小鼠花更多的时间探索陌生小鼠。VPA暴露小鼠的理毛时间相较于对照组明显升高,说明TO改善VPA小鼠的社交能力和刻板重复行为。（4）BrdU和DCX染色结果显示,和野生小鼠相比,BTBR小鼠海马齿回内BrdU和DCX免疫反应阳性细胞数明显减少,TO处理后可以使BTBR小鼠海马内BrdU和DCX阳性细胞数量明显增加。（5）BrdU和DCX染色结果显示,和对照组相比,VPA暴露小鼠海马齿回内BrdU和DCX免疫反应阳性细胞数量明显减少,TO处理后可以使VPA暴露小鼠阳性细胞数量明显增加。研究结论:上述实验结果表明:LXRβ可以通过Notch1调控海马早期发育,LXRβ缺失后可能导致海马早期发育异常并使小鼠产生社交障碍和刻板重复样行为,同时也导致小鼠海马中与自闭症相关的基因发生改变。肝X受体激动剂TO901317可以促进BTBR和VPA暴露小鼠海马神经发生,并改善小鼠的社交能力,减少刻板重复样行为。