白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病,在我国年发病率约为3～4/10万,且呈逐年增加趋势。目前白血病治疗手段以化疗为主,或进行骨髓和干细胞移植,取得了一定的治愈率和缓解率。但化疗毒副作用大,复发率高：而移植配型困难,应用有限；同时高昂的医疗费用对家庭、社会造成了沉重的负担。因此,在原有基础上,能单独或联合使用一种更为简便且安全有效的治疗方法显得极为重要。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是指给予光敏剂后配合光照射的一种新型的肿瘤治疗方法。被可见光激发后,光敏剂主要通过Ⅰ型和Ⅱ型两种光氧化途径产生反应,导致细胞损伤。与常规癌症治疗方法相比,PDT优点颇多,如可直接作用于肿瘤局部,全身性毒性小,疗程可重复,对耐药肿瘤细胞有效,并可与其他疗法如化疗和放疗联合应用。自上世纪70年代以来,PDT已在多国应用于肿瘤治疗,目前其应用多数聚焦于皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌等浅表或空腔器官肿瘤的局部治疗。金丝桃素(Hypericin, Hyp)为藤黄科金丝桃属植物贯叶连翘提取物的主要活性成分,化学结构属于萘并二葸酮类,已作为抗病毒、抗抑郁药物在临床上应用多年,其安全性得到广泛认可。同时,作为一种强有力的天然光敏剂,金丝桃素还具有较强的光依赖性抗肿瘤活性和低光照下毒性低的特点,对球状体细胞有选择性积聚效应(注：人体正常白细胞及白血病细胞亦属于球状体细胞),且吸收光波长高,富有穿透性,有利于杀伤血液中的白细胞,高度符合白血病治疗理想光敏剂的特点。大量体外和临床试验表明金丝桃素介导的光动力疗法(Hyperin mediated photodynamic therapy, Hyp-PDT)对多种肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。集聚于肿瘤组织、血管及基质中并被可见光活化后,金丝桃素主要通过线粒体途径产生活性氧,从而导致外源性或依赖于caspase的内源性凋亡。此外,Hyp-PDT还对细胞自噬有较大影响。自噬对肿瘤细胞的作用具有双向性：自噬有时可阻止细胞内蛋白合成,抑制肿瘤的生长发育：而有时自噬又可增加肿瘤细胞对缺氧与营养缺乏的适应,清除细胞内的活性氧,起到保护肿瘤细胞的作用。血液系统肿瘤因具有全身播散的特点,从而需要全身性治疗；且由于血细胞包括白血病细胞是在人体的封闭血管系统中流动的,无法直接照射,故而如何将Hyp-PDT引入血液系统,是当前比较困惑的问题,也限制了Hyp-PDT在血液系统疾病的研究。目前国内外研究主要致力于利用PDT对白血病细胞进行体外净化,以解决自体骨髓移植中白血病细胞的残留问题,且多数止步于体外实验。有人曾提出通过在小鼠尾静脉中插入光导纤维实施血管内PDT,结果表明对肿瘤细胞生长有阻滞作用,但此法光源受限较大,且对血管壁及周边组织损伤严重。故而本研究创新性地提出将大鼠血液引流至体外血流环路实施光照,以激发光动力学效应,从而在体杀伤靶细胞,同时避免对血管周边组织的光毒性损伤。为了便于光照,我们自行研发倒置可调功率光动力学照射平台(0.1 mW/cm2至40mW/cm2),以黄色矩阵式LED灯为照射光源,其主波长为595纳米,与金丝桃素的最大吸收波长相匹配,并避开RBC中Hb的吸收波峰。薄层玻片体外循环环路亦为本课题组精心设计,与大鼠动静脉相连后,可通过大鼠自身体内动静脉压力差驱动血流在体外缓慢而顺畅低流动(9μl/s),并通过透明玻片接受光照。本课题组尝试将Hyp干预后的大鼠血液导出体外,引流入玻片夹层,形成薄层血流,施与高强度的光照,以探索经体外血流环路Hyp-PDT对大鼠外周血白细胞的影响,并观察Hyp-PDT对血液中其他细胞及机体是否造成损伤；同时观察Hyp-PDT对体外培养的人白血病细胞株K562的杀伤作用并深入探索其相关机制和作用通路；最后,我们通过薄层玻片系统模拟白血病大鼠的体外血流环路对U937细胞和K562细胞实施Hyp-PDT,以验证通过体外环路对白血病细胞实施Hyp-PDT的可行性,希望增加新的白血病治疗策略,从而改善白血病患者的健康。第一部分经体外血流环路Hyp-PDT治疗对大鼠正常白细胞的杀伤作用及对其它血细胞的影响目的：初步探索经体外血流环路Hyp-PDT;对大鼠正常白细胞的影响及其可能的副作用,确认体外循环下实施Hyp-PDT的有效性。方法：所有实验动物随机分为4组：Sham组(假手术组),EBL组(体外环路组),EBL+Hyp组(体外循环+金丝桃素无光照组),EBL+Hyp-PDT组(体外循环+金丝桃素介导的光动力学治疗组),每组5只。通过颈总动脉与股静脉插管并连接薄层玻片系统建立体外血流环路以构建体外循环SD大鼠模型。EBL+Hyp-PDT组腹腔注射金丝桃素3 mg/kg,给药后4h行插管手术,术后1.5 h连接体外环路进行1 h光照(595 nm波长)实施Hyp-PDT; EBL+Hyp组进行1 h的体外循环但无光照,其余同EBL+Hyp-PDT组；EBL组手术前4h腹腔注射等量DMSO生理盐水,术后1.5 h连接体外环路进行1h的体外循环；Sham组同时间点腹腔注射等量DMSO生理盐水溶液,仅进行插管手术,但不连接体外血流环路。所有体外循环大鼠分别于给药前(T1)、手术前即给药后4h(T2)、手术后0.5h(T3)、光照前即手术后1.5h(T4)、光照后1.5h(T5)、光照后3h(T6)经尾尖或颈总动脉采血测血常规,Sham组也于相应时间点进行检测；分别于给药前和光照后3h或相对应时间点测肾功能；于给药前、光照前和光照后3 h采血做血涂片；并于给药前、给药后3 h、给药后6 h、给药后9 h收集中性粒细胞,荧光显微镜观察细胞对金丝桃素的摄取情况。结果：1)给药后3 h血液中白细胞可见微弱荧光,注射后6 h和9 h均可见大量白细胞有强烈的橘红色荧光。2)血常规结果显示,各组术后均可见白细胞显著性升高并于1 h回落至术前水平,但同时间点各组间无显著性差异。EBL+Hyp-PDT组的白细胞计数于光照后1.5 h及光照后3 h持续下降(均P<0.05),较给药前分别下降约30%及47%；而与各对照组光照后同时间点相比,该组白细胞亦显著下降(均P<0.05)。血涂片显示光照后白细胞数量减少,高倍下可见变形破损的白细胞,但红细胞和血小板形态计数无显著改变。3)与给药前相比,各组红细胞计数在手术后有所下降(均P<0.05),但各组内光照或体外循环前后及各组间同时间点相比并无显著性差异。除Sham组外,各组血小板计数在手术后有所下降(均P<0.05),但各组内光照或体外循环前后及各组间同时间点相比并无显著性差异。4)各组大鼠不同时间点血肌酐和尿素氮无显著差异,组间同时间点相比亦无差别。结论：1)腹腔注射3mg/kg金丝桃素DMSO生理盐水溶液不会导致大鼠出现溶血反应,给药后6小时大鼠血液白细胞对金丝桃素摄取良好,并可持续一段时间。2)以金丝桃素作为光敏剂,通过体外血流环路用595nmLED灯照射1h,可有效杀伤大鼠血中白细胞,但对红细胞和血小板并无显著损伤。3)通过本课题组设计的薄层玻片系统进行1h的体外循环后,大鼠肾功能无显著损伤。第二部分Hyp-PDT对体外培养的人白血病细胞株K562的杀伤作用目的：观察Hyp-PDT对体外培养的人白血病细胞株K562的杀伤作用并寻求Hyp-PDT作用的最佳条件,同时探索自噬和凋亡在其中的作用。方法：体外培养人白血病细胞株K562,探索不同光强度(0.1,0.3和0.5mW/cm2)、不同浓度金丝桃素(0,0.2,0.4,和0.8 μg/ml)及不同光照时间(0,2,4,和8 min)下实施Hyp-PDT对细胞的杀伤作用,CCK-8测定体外细胞活性变化并比较。确定Hyp-PDT的最适实验条件后,分别于光照前即刻、光照后4h、8h、16h收集细胞蛋白,免疫印迹实验测定凋亡及自噬相关蛋白表达的变化；光镜和电镜观察细胞形态学改变。结果：1)与DMSO组及金丝桃素无光照组相比,0.4μg/ml金丝桃素孵育后,以0.3和0.5 mW/cm2的光强度照射可显著降低所有时间点的细胞活性(均P<n01)。然而,加入同等浓度的金丝桃素后以0.1 mW/cm2的光强度进行照射仅见光照后细胞活性轻微下降,但无统计学意义。因0.4 μg/ml的光强度可显著杀伤K562细胞,但又不致伤害过度,可作为进一步实验的最适照射光强度。2)Hyp-PDT对K562细胞的杀伤作用呈现金丝桃素浓度和光照时间依赖性；而0.8μ g/ml的金丝桃素孵育后光照8分钟可使细胞活性最低降至5%。但是0.2 μ g/ml的金丝桃素浓度下进行光动力疗法似乎对K562杀伤作用不大,仅在8min光照组出现显著性下降。3)光镜下可见光照后出现大量凋亡细胞,胞体皱缩,边缘模糊,折光性显著下降,亦有部分细胞坏死。4)透射电镜显示Hyp-PDT处理后h即可见凋亡小体的出现,光照后16h凋亡加重。K562细胞光照前即可见自噬体；光照后8小时,DMSO组中的自噬小体数量有所增多,但金丝桃素组自噬性改变显著减少,自噬小体几不可见。5)WB结果显示光照后,金丝桃素组cleaved caspase-3, cleaved caspase-9表达增多,但DMSO组光照前后无变化；光照后8h和16h,用药组LC3蛋白表达减少,而DMSO对照组则略有升高；用药组的Beclin-1于光照后16h出现下调,同时间点可观察到p-Akt蛋白表达的减少。结论：1) Hyp-PDT对K562细胞具备有效的杀伤作用,且该作用呈光强度、金丝桃素浓度和光照时间依赖性;2)金丝桃素(浓度0.4 μ g/ml)孵育5h后,以595nm波长LED灯(光强度为0.3 mW/cm2)照射4分钟为K562细胞Hyp-PDT的最佳实施方案。3)实施Hyp-PDT后,电镜下观察凋亡增加,凋亡相关蛋白Caspase-3、 Caspase-9活性上调,说明Hyp-PDT可通过Caspase途径诱导细胞凋亡。4)LC3、Beclin-1蛋白表达下调,电镜下观察到自噬体显著减少,表明Hyp-PDT可通过抑制K562自噬促进细胞死亡,该作用可能与Akt通路的抑制有关。5)Hyp-PDT可能通过抑制K562细胞的自噬,增加细胞凋亡率,起到杀伤肿瘤细胞的作用。第三部分Hyp-PDT影响体外培养的人白血病细胞株K562凋亡与自噬的MAPK通路机制目的：进一步深入探索p38MAPK、ERK、JNK等通路在Hyp-PDT对白血病细胞K562凋亡和自噬改变中的作用方法：分别于光照前即刻、光照后4h、8h、16h收集细胞蛋白,检测ERK、JNK、P38等通路蛋白表达。结果：金丝桃素组光照后4h即出现p-ERK的表达,且其活性随着时间而增加,而DMSO组并无ERK的激活。p-JNK的表达在Hyp-PDT后显著增加,于光照后4h表达最强,p-P38的表达在Hyp-PDT后亦有显著增加。而总ERK、总JNK和P38表达较光照前无显著。结论：1)Hyp-PDT后ERK、JNK、P38三条通路的磷酸化表达均增加,但总ERK、总JNK、总P38水平并无改变,认为]Hyp-PDT对以上通路的调节主要通过增加其磷酸化程度,但并不上调其基因水平。2)Hyp-PDT可通过促进ERK、JNK、P38三条通路的磷酸化表达,诱导K562细胞凋亡。3)Hyp-PDT对K562自噬的抑制可能与ERK、JNK、P38三条通路的磷酸化增加有关,其具体关系尚需进一步研究。第四部分Hyp-PDT通过薄层玻片循环对人白血病细胞株K562和U937的杀伤作用目的：使白血病细胞模拟体外血流环路进行循环,探索其作用条件并验证Hyp-PDT对其的有效杀伤性方法：体外培养白血病细胞K562和U937,加入浓度为0.4μ g/ml的金丝桃素孵育5 h后,参照第一部分中大鼠在体实验时的血液流速(9μl/s),使细胞悬液在微泵的作用下匀速通过薄层玻片系统,同时实施Hyp-PDT(光照波长为596 nm,白血病细胞经过外循环系统照射时间为15秒左右,光强度设定为1mW/cm2) 。CCK-8法测定细胞存活率,相差显微镜观察Hyp-PDT前后K562和U937细胞形态学变化。结果：1)CCK8显示光照后K562细胞和U937细胞损伤严重,与光照前相比,其细胞活性分别下降了92.65%及98.27%。2)显微镜下可见Hyp-PDT后K562和U937均出现显著凋亡,亦可见坏死细胞及碎片。结论：通过薄层玻片系统模拟体外血流环路对U937细胞和K562细胞实施Hyp-PDT,单次循环可有效杀伤白血病细胞。综上所述,本课题的研究成果不但证实了Hyp-PDT对白血病细胞的有效杀伤作用和可能通路,更重要的是提出了可以通过体外血流环路实施全身性PDT,为血液系统肿瘤的治疗提出了崭新的思路和策略,也为抑制某些非血液系统肿瘤的血路转移也提供了一种的可能性。