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研究目的本课题将以膀胱Cajal间质细胞（Interstitial cells of Cajal,ICC）为研究对象,以内质网应激--未折叠蛋白反应为切入点,揭示越婢汤调节膀胱样ICC细胞数量,从而改善膀胱不稳定状态所致的遗尿症的本质以及相关机制,同时为中医“提壶揭盖”法从现代实验科学做出前期依据。研究方法实验一:采取近端尿道结扎法建立膀胱出口梗阻（bladder outlet obstruction,BOO）动物模型,并制备膀胱ICC样细胞悬液,然后将BOO造模成功的wistar大鼠,雌性,60只,尾部流水编号随机分成越婢汤中药古方组、越婢汤高剂量组、越婢汤中剂量组、越婢汤低剂量组、缩泉丸组、灭菌水对照组6组。煎熬中药并依次大鼠灌胃,每只2ml,早晚各灌1次,连续灌14d。对照组予灭菌水灌胃,每只2ml,早晚各1次,连续灌14d。在最后一次给药2h内,于腹主动脉处取血,制备含药血清。实验二:在实验一基础上,予越婢汤各组含药血清干预膀胱ICCs,观察EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）染色法中细胞增殖的变化,用TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyl transferasedUTPnick end labeling,TUNEL）法染色检测细胞凋亡和CFSE（Carboxyfluorescein succinimidylester,CFSE）/PI（Propidium Iodide,PI）双染检测细胞存活率。实验三:观察越婢汤对膀胱ICCs内质网应激相关通路中促生存信号和促凋亡信号的影响,通过转录水平,蛋白定量、蛋白定性的不同层次,分别测定了活化转录因子6（Activating transcription factor6,ATF6）、葡萄糖调节蛋白78（Glucose-regulated protein 78,GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶12（Cysteine aspartic acid specific protease12,caspase-12）、c-JUN氨基端激酶（C-JUN NH2-terminal kinase,JNK）等相关基因的表达情况。实验四:采用Fluo 3-AM探针标记钙离子,荧光显微镜观察绿色荧光强度,检测细胞内钙离子的浓度。研究结果1.体外ICC样细胞的培养和鉴定:大鼠膀胱处提取细胞,24h后细胞贴壁,细胞形态与文献报道基本一致,光学图片证实雌性大鼠膀胱内Cajal样细胞的存在。进一步实验用c-kit免疫荧光染色法标记cajal细胞,结果呈阳性（绿色荧光）,胞体和突起均明显着色,再次证实了所提取的细胞为cajal间质细胞。2.含药血清对ICCs增殖的影响:灭菌水对照组ICCs有最强的增殖能力;越婢汤低-中-高剂量组,随着药物浓度的增加,对ICC细胞的增殖能力逐渐减弱,其中古方组与低剂量组中细胞的增殖能力接近;缩泉丸组药物血清可影响细胞的增殖能力,与越婢汤高剂量组细胞的增殖能力接近。3.含药血清对ICCs凋亡的影响:灭菌水对照组无诱导细胞凋亡的能力;越婢汤低﹑中﹑高3组,随药物浓度升高凋亡细胞增多,呈一定量效关系。缩泉丸组和古方组中的凋亡细胞较少,且与低剂量中的凋亡细胞数目基本相同,表明这3组药物对细胞凋亡能力接近。4.促生存信号的表达:从转录水平,蛋白定量、蛋白定性的不同层次来看,越婢汤各剂量组ATF6﹑GRP78等促生存信号的表达增高明显,与灭菌水对照组比较,具有显著性差异（P<0.05）。且随着越婢汤从低-中-高,浓度的不断升高,ATF6﹑GRP78蛋白的表达量不断增加,呈剂量依赖性。缩泉丸组ATF6﹑GRP78蛋白的表达明显,与灭菌水对照组比较,亦具有显著性差异（P<0.05）。5.促凋亡信号的表达:从转录水平看,越婢汤各组可下调其mRNA表达水平;但是从蛋白定性﹑半定量来看,越婢汤不同剂量组对JNK、CHOP、caspase-12的蛋白表达量影响不明显,与灭菌水对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。缩泉丸组24h后3个不同层次CHOP﹑JNK﹑caspase-12等基因的表达呈低水平表达,但与灭菌水对照组比较,差异亦无统计学意义（P>0.05）。6.含药血清对细胞内游离钙浓度的影响:含药血清处理ICC细胞24h后越婢汤低﹑中﹑高﹑古方各组,缩泉丸组均未引起细胞内Ca2+浓度的升高。研究结论1.越婢汤可以显著抑制Cajal细胞的增殖能力,但诱导细胞凋亡能力不足。2.越婢汤可以下调膀胱样ICC细胞数量,进而调节膀胱不稳定状态所致的遗尿症。其可能的机理是:越婢汤通过内质网应激--未折叠蛋白反应,诱导了ATF6﹑GRP78等促生存信号的高表达,恢复了ICC细胞的正常生理功能,维持了内质网的稳态。3.从中医“提壶揭盖”方向论治遗尿症的方法可行。