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肌萎缩侧索硬化症(ALS)是由于上、下运动神经元变性导致延髓、四肢、躯干、胸部及腹部肌肉逐渐无力和萎缩,多因呼吸肌功能衰竭而死亡。其年发病率约为5/10万-7/10万,成年起病,患者多在首次出现症状后的3-5年内死于呼吸衰竭,并且近年有上升的趋势。目前尚无有效治疗方法,目前唯一被美国FDA批准的临床药物是利鲁唑(riluzole),但仍无法完全阻止疾病的进展,仅可使ALS患者的生存期平均延长3个月以上。其他的治疗措施还包括维生素、神经营养因子及基因治疗等,但都没有确切效果。肌萎缩侧索硬化症的病因及发病机制尚不明确。可能相关的因素有:突变SOD1蛋白的毒性、与星形胶质细胞的相互作用、TDP-43蛋白、炎症、线粒体功能异常、谷氨酸盐兴奋毒性、内质网应激等。目前用于ALS研究的动物模型有多种,常用的动物模型是SOD1突变小鼠模型,其中表达人突变SOD1-G93A(第93位甘氨酸(Gly)突变为丙氨酸(Ala))的小鼠模型是迄今为止最经典、最接近人ALS的动物模型。其运动行为及病理变化与人类ALS极为相似,且症状出现前已有肌电图改变和线粒体损伤,便于ALS的早期研究。2006年8月,日本学者Shinya Yamanaka首次通过导入4种基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,将分化成熟的小鼠正常体细胞,重新诱导成为一个多功能的干细胞,具有类似胚胎干细胞的所有特性,将其命名为诱导性多能干细胞(iPS)。07年11月,日本和美国研究人员分别利用人体皮肤成纤维细胞诱导出人类的iPS细胞。iPS细胞在形态学、基因表达状况和表观遗传修饰方面都与ES细胞十分相似。这些研究明确地证实了已分化的细胞可以通过少数几个基因的外源导入而被重编程到具有多能性的状态。iPS细胞的应用价值在于获得方法相对简单和稳定,在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPS细胞具有与胚体干细胞相似的形态学特点及生物学特性,目前对于iPS细胞的神经分化方案,与胚体干细胞的神经分化方法类似。已经有研究报道将鼠的iPS细胞分化为多巴胺能神经元、神经胶质细胞等;将人的iPS细胞分化为运动神经元、少突胶质细胞等。但是,SOD1G93A基因突变是否会影响iPS细胞的诱导建立,以及是否会影响iPS细胞的神经分化尚不明确。有鉴于此,本实验的主要研究思路是,首先通过原代细胞培养法得到鼠尾成纤维细胞,转染逆转录病毒诱导iPS细胞的产生;然后对iPS细胞进行多能性鉴定后确认具有胚胎干细胞特性;最后选取神经元组织特异启动子的慢病毒转导iPS细胞,对转导后的细胞进行神经诱导分化,对所得到的荧光细胞进行鉴定和分析。本研究主要分为两个部分:
第一部分SOD1G93A小鼠诱导性多能干细胞的建立及鉴定。
目的:利用逆转录病毒载体质粒,通过病毒包装技术产生相应病毒,转染SOD1G93A小鼠成纤维细胞。目的在于获得iPS细胞并进行多能性鉴定。
方法:⑴通过组织块贴壁法培养SOD1G93A小鼠的鼠尾成纤维细胞。⑵将四种表达载体质粒转染PLAT-E细胞,收集病毒,转染成纤维细胞。⑶iPS细胞生物学特性的分析:对iPS细胞的分子标记及体内、外分化能力进行检测。
结果:①剪鼠尾组织,培养得到生长旺盛的鼠尾成纤维细胞。②包装逆转录病毒并转染成纤维细胞得到胚胎干细胞克隆样的iPS细胞。③iPS细胞生物学特性:iPS细胞表达AKP、Oct4、SSEA-1,在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。iPS细胞具有胚胎干细胞特性。
结论:⑴诱导建立了SOD1G93A小鼠的iPS细胞。⑵小鼠iPS细胞具有与ES细胞相似的生物学特性。
第二部分:Tα1α-tubulin/hrGFP慢病毒载体转染iPS细胞及神经分化研究。
目的:将神经元组织特异性启动子2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP慢病毒载体分别转导小鼠ES细胞和iPS细胞,抗性药物筛选后进行神经诱导分化,目的在于获得稳定携带该启动子的小鼠ES细胞和iPS细胞克隆,并诱导分化为神经细胞。
方法:⑴将2K7puro/Tα1-α-tubulin-hrGFP的表达载体与ViraPowerTM LentiviralPackaging Mix共转染239FT细胞48h至72h后,收集病毒上清液高速离心后,得到浓缩的病毒颗粒。⑵通过分次转导的方法将慢病毒转入小鼠E14、iPS细胞。转导后第3天开始使用1-5μg/ml嘌呤霉素筛选7天以获得带有表达质粒的纯化的E14、iPS细胞。⑶加入诱导试剂促进E14、iPS细胞向神经细胞分化,获得表达Tα1-α-tubulin的绿色荧光细胞,并进行免疫组化和功能染色等的相关鉴定分析。
结果:①慢病毒转导3天后,加入1-5μg/ml的嘌呤霉素开始筛选,观察到有一定量的细胞死亡。筛选一周后,得到抗嘌呤霉素的携带外源质粒的纯化的E14、iPS细胞。②加入各种诱导试剂促进iPS细胞向神经元分化,获得了表达Tα1-α-tubulin的绿色荧光细胞,进行流式细胞分析并分选后,经免疫染色证实为神经元。
结论:⑴利用慢病毒转导小鼠iPS细胞,转导后的iPS细胞经过筛选获得纯化的细胞群,细胞生长和分化能力不受病毒转导的影响。⑵诱导携带神经元组织特异启动子的iPS细胞分化为表达绿色荧光的神经元,为以后分化机理和移植治疗的研究提供了很好的工具。⑶SOD1G93A基因突变的小鼠iPS细胞其神经分化效率与正常小鼠ES细胞、iPS细胞的神经分化效率无显著差异。