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目的:胃肠外营养(Parenteral Nutrition,PN)临床应用已三十余年,对提高肠衰竭婴儿、儿童和成人的生存率的作用已被公认,但长期应用PN相关的肝胆功能损害是常见而棘手的并发症,新生儿主要表现为肝内胆汁淤积(PN-Associated Cholestasis,PNAC),尤其多见于早产儿。为了有效预防和治疗PNAC,更安全在婴儿和新生儿使用PN,对其发生和发展的机制进行探索和研究是国际上的热点。近年有报道PN相关肝损害与氧化损伤相关。而PN相关肝损害是否与肝细胞凋亡有关尚少见报道。本研究在建立幼兔PN相关肝损害模型基础上,探索氧化损伤及凋亡在PN相关肝损害机制中的作用;同时观察谷胱甘肽(glutathione,GSH)和中药丹参对预防或减轻PN相关肝损害的可能性及其保护作用机制。
材料与方法:
1、PN动物模型建立。将生后2周左右(12～16天)的20只新西兰种白兔,分为两组:(1)正常对照组即母乳喂养(n=10,control组)；(2)肠外营养组即PN应用10天(n=10,PN组)。通过对PN组幼兔颈静脉置入硅胶管,连续24小时输注静脉营养液,10天后比较两组间血清肝功能生化指标、肝脏病理及电镜下肝细胞细胞器的变化。
2、PN相关肝损害中肝细胞氧化损伤及凋亡机制实验研究。幼兔PN模型制作实验方法同第一部分。在实验结束时检测(1)检测肝细胞超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性(采用比色法,Superoxide Dismutase(SOD)Assay Kit,Calbiochem()公司)；(2)用硫代巴比妥酸法(TBARS法)测定肝组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量:(3)用免疫印迹法(Western-blotting)检测肝细胞线粒体释放细胞色素C含量；(4)用ELISA法检测肝细胞caspase-3活性(caspase-3 Activity Assay Fluorometric kit,Calbiochem()公司)；(5)应用原位末端标记法(TUNEL法)检测肝细胞凋亡。SOD活性减低与MDA含量升高是氧化损伤的主要指标,TUNEL法是检测细胞凋亡的经典方法,caspase-3和细胞色素C分别代表凋亡的两种途径:死亡受体途径和线粒体途径。结果进行组间比较,观察幼兔PN相关肝损害中氧化损伤及凋亡的相关机制。
3、在第一、二部分的研究基础上,选用两种临床常用药物,还原型谷胱甘肽和中药丹参(近年研究表明,这2种药物都具有抗氧化、抗凋亡的作用),观察它们对幼兔PN相关肝损害的保护作用及作用机制。在第一部分实验的基础上PN营养液中分别加入还原型谷胱甘肽(n=10)和中药丹参(n=10),比较4组幼兔肝功能和肝脏光镜、电镜病理变化及SOD、MDA含量,caspase-3活性,细胞色素C含量以及肝细胞凋亡等情况,观察两种药物的防治作用。
统计分析:采用SPSS for Windows13.0软件包作统计分析,组间比较采用方差分析或非参数检验,P<0.05时有显著统计学意义。
结果:
1、PN组血清胆汁酸、胆红素均明显高于正常对照组；肝脏组织可见门脉区炎性细胞浸润,有肝细胞变性坏死或胆汁淤积的表现。在电镜下主要表现为胞浆空泡样变,毛细胆管微绒毛稀疏等。
2、与对照组相比,PN组肝细胞SOD活性降低,MDA含量升高；肝细胞胞浆细胞色素C水平升高,caspase-3活性增强,TUNEL法检测出现明显肝细胞凋亡。
3、GSH及丹参两种药物保护作用下,与PN组比较,均有降低血清胆红素和胆汁酸浓度,改善肝脏病理变化,减轻毛细胆管损伤等表现,并能提高肝细胞SOD活性,降低肝组织MDA含量,减轻肝细胞氧化损伤；同时降低肝细胞胞浆细胞色素C水平,抑制caspase-3活性,减少肝细胞凋亡。
结论:
1、幼兔应用PN10天后,其生化、病理和电镜改变显示肝脏损伤,与文献报道婴幼儿PN相关肝损伤相类似。
2、幼兔PN肝损伤模型中存在氧化损伤,并启动肝细胞凋亡,导致肝损害。其机制可能是PN某些配方成分应用过程中脂质过氧化产生肝脏氧化损伤,同时氧化损伤损害线粒体膜,促使线粒体膜通透性增加,释放细胞色素C等凋亡相关因子,激发caspase-3等级联反应,产生肝细胞凋亡,导致肝损伤。氧化损伤是PN相关肝损害的重要机制之一；而由氧化损伤启动的,线粒体介导的肝细胞凋亡在其中起到重要作用。
3、GSH和丹参具有抗氧化,抗凋亡作用,能有效预防或减轻幼兔PN相关肝脏损害。