论文部分内容阅读
一、研究背景与目的百草枯(paraquat, PQ)中毒是继有机磷农药中毒之后最常见的农药中毒,其中毒后最严重的损害为急性肺损伤和随后的进行性肺纤维化,死亡率达80%,当前无特效治疗方法。氟非尼酮(fluorofenidone, AKF)是一种潜在治疗PQ致急性肺损伤的化合物,但其口服或注射给药后在体内分布广泛,无靶向性,将AKF蓄积在肺组织,针对性地缓解PQ中毒引起的肺部损伤,可更好地发挥AKF治疗作用。本课题以乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体材料,采用乳化溶剂挥发法制备肺靶向载AKF微球(microspheres, MS),考察其经尾静脉注射后在大鼠肺组织的靶向性,并初步探讨其对PQ致大鼠急性肺损伤的治疗作用。二、方法与结果1. AKF-PLGA-MS的制备及制剂特性评价以PLGA为载体材料,采用乳化溶剂挥发法制备AKF-PLGA-MS。以包封率(EE%)和载药量(DL%)为评价指标,单因素考察了PVA浓度(%)、药载比(w/w)、有机相与水相体积比(v/v)、搅拌速度(rpm)等处方、工艺因素对微球制剂特征的影响,再通过正交设计确定处方,并对制备的微球外观形态、粒径分布、包封率和载药量、稳定性、体外释放等进行评价。AKF-PLGA-MS优化处方为：二氯甲烷与PVA(2%)溶液体积比1：10,AKF与PLGA质量比1.5：5,搅拌速度1500rpm；优化处方制得的微球平均粒径为18.1μm,跨距为1.5,粒径7-30μm的微球占80%左右；包封率及载药量分别为80.2±2.5%、8.2±1.9%;该微球在25℃及4℃下储存15天,其外观形态、包封率和载药量无明显变化,稳定性良好。同法制备了平均粒径为3.9μm,跨距为1.6的微球,用于对照。AKF-PLGA-MS在体外6h内累积释药约20%,96h累计释药67%；体外释药曲线符Korsmeyer-Peppas模型,Q=11.141·t0.292292(R2=0.9797),提示AKF-PLGA-MS在PBS (pH7.4)中释药机制为Fick’s扩散。2. AKF-PLGA-MS在PQ致急性肺损伤大鼠体内分布及靶向性评价以雄性SD大鼠为研究对象,HPLC法测定血浆及组织中AKF浓度,考察AKF注射液、AKF-PLGA-MS (3.9μm)、AKF-PLGA-MS (18.1μm)体内分布情况,并以相对摄取率、靶向效率、峰浓度比等评价其靶向性。结果发现,在给药后的全部取样时间点,AKF-PLGA-MS (18.1μm)组肺组织中AKF浓度均高于注射液组和AKF-PLGA-MS (3.9μm)组,且第12、24、48h时差异有统计学意义(P<0.05)；同时,AKF-PLGA-MS (18.1μm)组肺组织中AKF浓度显著高于同组大鼠血浆、心、肝、脾、肾组织中浓度；在24、48h时,注射液组AKF浓度低于检测限,而AKF-PLGA-MS (18.1μm)组大鼠肺组织的浓度为2.7±1.2、1.5±0.8μg·mL-1,表明AKF-PLGA-MS (18.1μm)较注射液有缓释性。与注射液相比,AKF-PLGA-MS (18.1μm)肺相对摄取率(Rel)为19.9,与AKF-PLGA-MS (3.9μm)相比,肺相对摄取率(Re2)为8.7。AKF-PLGA-MS (18.1μm)肺组织相对其他组织或血液的靶向效率Te(心、肝、脾、肾的靶向效率分别为83.9、21.5、27.1、29.4、44.8)均远大于1。AKF-PLGA-MS (18.1μm)、AKF-PLGA-MS (3.9μm)及AKF注射液肺总靶向系数(TCe)分别为86.8%、18.9%、13.6%。AKF-PLGA-MS (18.1μm)和AKF-PLGA-MS (3.9μm)肺峰浓度比(Ce)分别为5.7、1.2,表明AKF-PLGA-MS (18.1μm)明显提高了药物在肺中的浓度。3.AKF对PQ致大鼠急性肺损伤的治疗作用为评价AKF对PQ致大鼠急性肺损伤的治疗作用,设置以下动物组(SD雄性大鼠)：空白对照组；阴性对照组；AKF注射液治疗组;AKF-PLGA-MS (3.9μm)治疗组；AKF-PLGA-MS (18.1μm)治疗组。除空白组(注射生理盐水)外,其余各组大鼠经腹腔注射PQ溶液(30mg/kg)建立急性肺损伤模型,0.5h后,分别尾静脉注射给药(剂量相当于30mg/kg AKF)。给药后0.5、6、12、24、48h时间点处死大鼠,取肺组织,观察肺部病理变化并测定肺组织中TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达水平。结果表明：与空白组相比,阴性对照组各时间点肺TNF-α、IL-1β和NF-κB显著升高(除0.5h, TNF-a P>0.05外,各时间点P<0.05)；各治疗组TNF-α、IL-1β和NF-κB亦显著升高(P<0.05),但均低于阴性对照组。与阴性对照组相比,在第0.5和24h时AKF-PLGA-MS(18.1μm)和AKF-PLGA-MS(3.9μm)组肺IL-1p显著降低(P<0.05)；第48h时AKF-PLGA-MS (18.1μm)组肺内TNF-α、IL-1β、NF-κB明显下降(P<0.05),表明AKF-PLGA-MS (18.1μm)可抑制TNF-α、 IL-1β、NF-κB的表达(P<0.05)；第48h时,AKF-PLGA-MS (3.9μm)组肺内IL-1β、NF-κB显著下降(P<0.05),对TNF-α的作用不明显(P>0.05)；第48h时注射液组IL-1p显著下降(P<0.05),对TNF-α, NF-κB作用不明显(P>0.05),表明AKF能有效控制部分炎症因子的表达。且第48h时AKF-PLGA-MS (18.1μm)治疗组肺IL-1β、NF-κB和注射液治疗组相比有统计学差异(P<0.05)。病理结果显示,阴性对照组大鼠6h后出现典型的急性肺损伤,肺毛细管血管扩张,炎性细胞浸润,24h和48h时肺泡结构破坏明显,肺泡间隔增厚；各治疗组24和48h也出现了病理改变,但程度上较阴性对照组轻,部分肺泡腔内可见少量渗出、出血。三、结论以PLGA为载体,采用乳化溶剂挥发法可制备包封率及载药量较高、稳定性好的AKF-PLGA-MS。与AKF注射液和粒径为3.9μm的AKF-PLGA-MS相比,粒径为18.1μm的AKF-PLGA-MS有显著的靶向性,可明显提高肺组织中AKF浓度,对PQ致大鼠急性肺损伤有更好的治疗效果；AKF减轻大鼠PQ中毒所致急性肺损伤,可能与抑制TNF-α、IL-1β和NF-κB的激活有关。