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冷却肉处于低温环境中,许多细菌的生长受到抑制,但肉中污染的一些嗜冷菌,在冷藏条件下仍然会大量生长和繁殖,最终导致冷却肉发生腐败变质。关于冷却肉污染微生物及贮藏过程中微生物的动态变化已有很多研究报道,但大多是基于传统微生物培养手段,而许多基于传统方法的研究并不能全面反映冷却肉中微生物动态变化的真实情况。近年来,基于16S rRNA基因分子技术正被越来越多地应用于食品微生物群落结构的研究。本研究的目的是运用变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、末端限制性长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphism, TRFLP),分析托盘包装冷却猪肉冷藏过程中菌相变化,运用DGGE及传统乳酸菌分离纯化技术,分析真空包装冷却猪肉冷藏过程中菌相变化,确定冷却猪肉两种包装方式下主要优势腐败菌,进一步运用Real-time PCR方法对主要优势腐败菌进行定量分析,进而揭示其贮藏过程中菌相变化规律,为控制肉品污染,提高产品质量安全提供科学依据。具体研究内容和结果如下：1.冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响运用分子生物学方法研究微生物的第一步骤就是样品DNA提取。前处理方法不同可能会影响DNA提取效果并进而影响后续的PCR等实验结果,故本实验比较研究冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响。冷却猪肉4℃贮藏至第5天时,分别采用冻融、超声、摇床和匀浆前处理后,提取肉中细菌DNA,进行Dilution-PCR和DGGE分析。结果表明,不同前处理方法所制备的DNA量稍有差别,而细菌16S rRNA基因V3区和V6-V8区PCR-DGGE结果无显著差异,所以可根据实际情况选择上述不同前处理方法,结合本实验室实际条件和本实验具体要求,确定后续实验样品前处理采用摇床法。同时对16S rDNA V3区的DGGE图谱进行割胶测序,检测到腐败菌主要是假单胞菌属,其他还有不动杆菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属。2.托盘包装冷却猪肉冷藏过程中菌相变化研究运用PCR-DGGE、TRFLP技术,研究托盘包装冷却猪肉冷藏过程中的菌相变化,确定主要优势腐败菌,进一步运用Real-time PCR中的△△CT方法对该菌进行定量研究。结果如下：选择性培养计数结果表明,贮藏过程中假单胞菌增长最为迅速,热死环丝菌和假单胞菌成为冷却猪肉贮藏末期主要优势腐败菌。直接提取冷却猪肉细菌DNA,其Dilution-PCR结果表明随着贮藏时间的延长,冷却肉中细菌量逐渐增多,这种半定量方法结果与传统培养计数结果趋势一致。可培养细菌的16S rRNA基因V3区和V6-V8区DGGE结果表明,冷却猪肉中可培养细菌的组成在不同贮藏时期是不同的。可培养细菌与不经培养直接提取冷却猪肉细菌DNA同时进行PCR-DGGE,16S rRNA基因V3区和V6-V8区DGGE图谱存在差异。直接提取冷却猪肉细菌DNA,分别对16S rRNA基因V3和V6-V8可变区进行PCR-DGGE分析,结合克隆测序,结果表明肉中初始菌相较复杂,贮藏末期主要优势腐败菌为假单胞菌,但V3可变区发现还有热死环丝菌,不同可变区结果不完全一致。本实验所得的假单胞菌克隆,基于不同可变区的DGGE分析,亦发现基于不同可变区进行DGGE研究时结果存在差异。直接提取冷却猪肉细菌DNA,进行PCR-TRFLP分析,同时结合16S rRNA基因克隆文库和测序方法,得到的TRFLP图谱中共产生35种谱带,表明冷却肉中微生物组成十分复杂,对应于假单胞菌的谱带峰贮藏过程中变化明显,其相对峰面积由O d的5.7%至贮藏末期达到83.4%,表明主要优势腐败菌为假单胞菌。运用Real-time PCR相对定量方法分析托盘包装肉样中假单胞菌。肉样中假单胞菌与总细菌两组标准曲线的斜率差值为0.004,小于0.1,表明两个基因的扩增效率已非常接近,可用AACT法对假单胞菌进行相对定量分析。AACT法相对定量表明贮藏过程中肉样中假单胞菌增长迅速,从0 d的小于0.001至贮藏末期达到4.438,在总细菌中所占比例迅速增高。综上所述,运用PCR-DGGE、TRFLP技术,研究托盘包装冷却猪肉冷藏过程中的菌相变化,确定主要优势腐败菌为假单胞菌,进一步运用Real-time PCR中的△△CT相对定量方法发现该菌增长迅速。三种方法证实了托盘包装冷却猪肉冷藏过程中假单胞菌为主要优势腐败菌。3.真空包装冷却猪肉冷藏过程中菌相变化研究真空包装冷却猪肉冷藏过程中,分离纯化乳酸菌,运用PCR-DGGE研究贮藏过程中乳酸菌的变化,同时不经培养直接提取肉中细菌DNA,运用PCR-DGGE及Lactobacillus group-specific PCR-DGGE方法,研究其贮藏过程中的菌相变化,确定主要优势腐败菌。进一步运用Real-time PCR中的△△CT方法对该菌进行定量研究。结果如下：选择性培养计数结果表明,真空包装条件下乳酸菌生长迅速,而其他细菌生长受到抑制,4℃贮藏时冷却猪肉货架期接近14 d。MRSA分离纯化的乳酸菌,运用PCR-DGGE结合16Sr RNA基因序列分析,真空包装冷却猪肉中共获得8种乳酸菌。不同贮藏时间乳酸菌组成不同,清酒乳杆菌成为贮藏末期最主要的乳酸菌,占71.4%。直接提取冷却肉细菌DNA,对16S rRNA基因V3区进行PCR-DGGE分析,结合割胶测序,结果表明贮藏末期乳酸菌(肉食杆菌、清酒乳杆菌、乳球菌)成为优势腐败菌。运用Lactobacillus group-specific PCR-DGGE研究发现,真空包装冷却猪肉冷藏过程中乳杆菌样细菌逐渐增多,贮藏末期清酒乳杆菌最多。运用Real-time PCR (?)目对定量方法分析真空包装肉样中乳酸杆菌。肉样中乳酸杆菌与总细菌两组标准曲线的斜率差值为0.096,小于0.1,表明两个基因的扩增效率已非常接近,可用△△CT法对乳酸杆菌进行相对定量分析。△△CT法相对定量表明贮藏过程中肉样中乳酸杆菌增长迅速,从0 d的小于0.001至贮藏末期达到3.696,在总细菌中所占比例迅速增高。综上所述,运用PCR-DGGE及Real-time PCR方法,确定真空包装冷却猪肉冷藏过程中乳酸杆菌为主要优势腐败菌。