研究背景软骨组织缺乏自我修复的能力,曾被认为是单一细胞成分。随着生物技术的发展,不断有研究者从关节软骨、鼻中隔软骨、软骨膜、椎间盘等组织中分离得到具有自我更新和多向分化能力的细胞群,称之为软骨干/祖细胞（cartilage-derived stem/progenitor cells,CSPCS）。CSPCS在软骨分化、软骨表型稳定和细胞外基质沉积方面具有优势,是软骨组织工程理想的种子细胞,逐渐应用到软骨组织工程和3D生物打印中。种子细胞的取材和分离是组织工程的基础。CSPCS分离方法多样,机制各不相同,尚未有统一的标准,优化筛选方法,有利于CSPCS在软骨组织工程中的广泛应用。此外,CSPCS来源部位多样,与关节、耳廓、鼻中隔软骨等相比,肋软骨具有组织量大、供区损伤可控、采取方法成熟的优势,作为CSPCS的组织来源时,细化肋软骨取材区域是需要解决的问题。因此,我们认为有必要进一步研究,优化CSPCS的筛选方法和取材部位,为CSPCS作为种子细胞构建组织工程软骨提供实验基础和研究参考。研究目的:1、优化肋软骨来源CSPCS的分离方法,对比不同方法分离得到的兔肋软骨来源干/祖细胞的差异。2、明确来源部位对CSPCS的细胞学行为和体外构建软骨组织的影响,优化CSPCS的精细取材部位。研究方法和结果:1、CSPCS的分离与鉴定方法:利用三种方法:纤维连接蛋白黏附+低密度筛选法（FN+LD组）,单纯纤连蛋白黏附法（FN组）,低密度筛选法（LD组）,分离得到CSPCS,检测表面间充质干细胞相关标志蛋白的表达。结果:三种方法筛选出的CSPCS均阳性表达间充质干细胞表面标记CD44和CD90。2、不同分离方法对CSPCS生物学行为的影响方法:利用克隆形成实验检测细胞自我更新能力;利用流式细胞分析检测细胞周期;利用细胞划痕实验进行细胞迁移能力检测;进行成骨、成脂和成软骨诱导,检测多向分化能力的差异。结果:联合方法和单纯纤连蛋白筛选法分离的CSPCS在扩增和分化方面优于低密度筛选法。3、来源部位对CSPCS细胞生物学行为的影响方法:对兔肋软骨全段进行分区:肋骨段软骨（R组）,近胸骨段软骨（B组）;分层:表层软骨（S组）,中心层软骨（D组）,分别提取CSPCS。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞增值情况;利用克隆形成实验检测细胞自我更新能力;利用TUNEL染色法检测细胞凋亡情况;利用划痕实验检测细胞迁移能力。结果:近肋骨段软骨来源CSPCS在细胞增殖、自我更新和耐受缺营养条件方面优于近胸骨段来源CSPCS,表层软骨来源CSPCS在细胞增殖、自我更新、细胞迁移和耐受缺营养环境方面优于中心层。4、来源部位对CSPCS体外构建软骨组织的影响方法:利用不同部位来源的CSPCS体外构建无支架的软骨组织。对比各组构建的软骨组织,利用阿利新兰染色、免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察进行细胞表面标志蛋白的检测和软骨组织结构的评价。结果:肋软骨来源的CSPCS具有良好的成软骨能力,各组体外构建的软骨组织细胞外基质沉积良好,新生软骨组织中CD146出现位置相关的差异性表达。研究结论1、纤连蛋白黏附+低密度筛选法、单纯纤连蛋白黏附法和单纯低密度筛选法均能获得CSPCS,其自我更新和分化能力差异与筛选方法有关,FN法和FN+LD法优于LD法。2、近肋骨段软骨和表层软骨来源的CSPCS细胞增殖和自我更新能力更强,耐受缺营养条件的能力更强,体外构建的软骨组织细胞外基质沉积更优。3、CSPCS作为种子细胞体外构建软骨组织时,近肋骨段和表层肋软骨可作为精细化取材的选择。