研究背景:中国是肝病大国,遭受肝病困扰的患者数量庞大,目前肝移植术（LT）已经成为公认唯一的治疗终末期肝病的临床策略。随着肝脏移植技术和策略的显著发展,术后并发症的发生率已大大降低,并且受者的长期存活率有了显着提高。然而,由于LT需求量的快速增长,在过去十年中,边缘供体肝的使用明显增加。这不可避免地导致了移植物质量下降和移植后的一系列严重并发症,这其中一个严重的并发症就是早期移植物功能不全（EAD）。EAD描述了LT后移植物最初时期功能较差的状态。EAD受者的生存期较差,因为EAD可能导致受者死亡或重新移植等不良后果。由于缺乏特定的动物模型,人们对EAD的潜在机制了解不甚全面。目前认为缺血再灌注损伤（IRI）是EAD发生的危险因素。以往的研究借助动物缺血再灌注（I/R）模型揭示了自然杀伤细胞（NK cell）作为固有免疫的组成部分之一在移植物IRI中扮演着重要角色,这意味着NK细胞或许也在EAD的发生发展中发挥着作用。为了避免EAD造成供体器官浪费,为这种快速发展且危及生命的并发症寻找具有预警意义的生物标志物和治疗靶标具有重要的临床价值。研究目的:旨在通过LT受者外周血中免疫细胞谱的动态变化来挖掘出具有EAD发生的预警意义的指标——NK细胞;基于已有的动物模型技术——小鼠I/R模型和大鼠LT模型,验证对NK细胞的干预在IRI和LT损伤中是否具有治疗效果;针对以上结果初步揭示EAD发生的相关信号通路和细胞损伤机制;为临床上EAD的诊断寻找到具有预警意义的生物标志物和EAD的治疗挖掘新型的治疗靶点。研究方法:第一部分:本项研究回顾性纳入了2017年4月1日至2019年8月1日期间在浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科中心接受LT的病人数据,共109例。我们采用由Olthoff于2010年提出的EAD定义作为诊断标准,即:（1）术后7天内最高血清谷丙转氨酶（ALT）＞2000 U/L;（2）术后7天内最高血清谷草转氨酶（AST）＞2000 U/L;（3）术后第7天血清总胆红素（TBil）≥10mg/d L;（4）术后第7天国际标准化比值（INR）≥1.6,满足其中一条即可。所纳入的109例的LT受者数据中,有74例在移植术后没有发生EAD,定义为non-EAD组,有35例发生了EAD,定义为EAD组,其中9例在术后第7天仍然保持EAD状态,定义为7dEAD组。将获取的临床化验数据进行动态分析比较（术前最近一次化验结果,术后2-4天化验结果,以及对应指标变化比例）,筛选出EAD发生的预警信号;进一步分析出影响LT受者EAD预后和转归的独立危险因素。基于Kaplan-Meier生存分析,明确这些危险因素对LT受者总体生存期（OS）的影响。第二部分:基于小鼠IRI模型和大鼠LT模型研究NK细胞在I/R过程中的响应过程。并使用医学数据库GEO进行数据分析,寻找到肝脏IRI前后表达量异常变化的分子——Toll样受体4（TLR4）。使用流式细胞术（FACS）追踪IRI后NK细胞的去向,并通过检测血清ALT、AST,观察组织病理切片炎症严重程度,肝脏细胞凋亡程度,促细胞凋亡相关蛋白分子表达量来研究抑制NK细胞和TLR4后对缺血再灌注损伤的治疗效果。第三部分:通过新型分析技术——RNA测序（RNA-seq）和质谱流式细胞技术（Cy TOF）分析IRI相关的信号通路和分子机制。通过RNA-seq分析出肝脏缺血再灌注后差异表达的基因,结合通路富集分析技术寻找到差异基因所关联的分子机制和信号通路,再联合Cy TOF分析技术寻找到肝脏IRI损伤后浸润程度有差异的细胞亚群。整合以上分析结果,初步构建出TLR4,NK细胞和肝脏IRI损伤之间可能存在的机制。研究结果:第一部分:比较non-EAD组和EAD组间移植受者外周血间免疫细胞谱的组分差异,发现在non-EAD组受者中,在术前中性粒细胞/白细胞比例（NWR）显著低于EAD组病人（0.226±0.035 vs 0.239±0.027,p=0.028）,淋巴细胞/白细胞比例（LWR）显著高于EAD组病人（0.074±0.040 vs 0.058±0.032,p=0.034）;在术后NK细胞比例显著高于EAD组病人（0.037±0.031 vs 0.027±0.015,p=0.008）;在各项指标的动态比较中,non-EAD组病人的NK细胞比例动态变化值（0.287±0.170vs 0.222±0.081,p=0.008）和NWR动态变化值（0.362±0.051 vs 0.344±0.039,p=0.042）均显著高于EAD组。进一步研究发现经历了LT后,无论是否发生EAD,受者外周血中的NK细胞比例会显著下降（0.106±0.070 vs 0.083±0.073,p＜0.0001）,并且在术后约1周左右恢复到术前水平。结合术中数据信息,我们发现NK细胞比例动态变化值,与冷缺血时间呈现显著负相关,NK proportion shift=-0.013*CIT+0.375,R2=0.54,p=0.016。通过Cox回归分析发现NK细胞比例动态变化值（HR=0.008,p=0.027）和ABO血型不相容（HR=0.174,p=0.003）是7d-EAD发生的独立危险因素;通过Kaplan-Meier生存分析发现NK细胞比例动态变化值可能与移植受者的总体生存率有关系。以上结果提示NK细胞可能是LT后受者发生EAD的关键因素,可以影响其预后和转归,是一个潜在的用来预测EAD发生的指标和预防及治疗EAD的新靶点。第二部分:在小鼠肝脏I/R模型中,我们发现IRI后小鼠外周血中NK细胞比例显著下降（p＜0.01）,而肝组织中显著上升（p＜0.001）;肝功能测定结果显示,IRI小鼠的ALT（p=0.001）和AST（p=0.005）均显著高于假手术组,组织病理切片显示在IRI小鼠的肝脏组织中炎性细胞浸润程度更高,免疫荧光结果显示IRI小鼠的肝脏细胞凋亡更严重,免疫印迹技术（WB）结果显示粗细胞凋亡分子Bax和C-caspase 3在IRI小鼠体内表达量显著升高。这说明外周血的NK细胞被募集到肝脏中,并且引发了更强的肝脏损伤。使用NK细胞抑制剂α-ASGM1可以减弱募集程度,并且通过肝功能,病理切片,免疫荧光和WB实验均可以发现它们可以缓解IRI带来的肝脏损伤。大鼠LT模型中也得到相似的结果,使用NK细胞抑制剂后大鼠移植肝的肝功能显著优于未使用的大鼠,病理切片结果示肝脏细胞破坏程度更轻。通过GEO公共数据库分析发现在肝脏I/R后,TLR4的表达量显著升高（p=0.007）,这提示我们在肝脏IRI过程中NK细胞的作用可能与TLR4有关。使用TLR4阻断剂TAK-242也能起到类似NK细胞抑制剂的效果,但两药联用不能给肝脏带来更大的获益。第三部分:通过RNA测序技术分析出IRI处理组（n=3）和α-ASGM1治疗组（n=3）小鼠肝组织中差异表达的基因,共465个（p＜0.05,倍数改变＞1.5）。通路富集分析显示,这些基因与细胞因子分泌负调控、免疫应答、白细胞稳态、趋化和血小板活化等免疫相关通路显著相关（p＜0.05）。Cy TOF分析显示,在两组小鼠肝脏浸润的免疫细胞中,存在差异的是CD49b-NK1.1+NK,CD49b+NK1.1+NK和CD8+CD127+T细胞。这一结果提示CD49b-NK1.1+NK,CD49b+NK1.1+NK和CD8+CD127+T细胞在小鼠肝脏缺血再灌注损伤中起关键作用,并且可被NK细胞抑制剂α-ASGM1干预。研究结论:肝移植后外周血NK细胞会被募集到移植肝中,这与EAD的发生及其结果有关。TLR4-NK-CD8+CD127+T细胞信号通路可能是I/R后治疗移植物损伤的关键通路。对NK细胞进行靶向抑制是一种在LT后保护肝组织避免EAD发生的潜在、新颖而有效的策略。