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研究背景:肝细胞肝癌(以下简称肝癌)是我国常见恶性肿瘤之一。由于缺乏早期临床症状和高效的筛查手段,大部分肝癌患者确诊时已处于中晚期,丧失了手术切除或者肝移植的治疗机会,只能选择局部治疗、化疗等姑息治疗手段,预后较差。索拉非尼是进展期肝癌的一线治疗药物,但仅约30%-40%的肝癌患者能从索拉非尼的治疗中获益。索拉非尼耐药是目前肝癌治疗中所面临的棘手问题。肿瘤干性与索拉非尼耐药密切相关。如何逆转肿瘤干性是克服索拉非尼耐药、增强肝癌疗效中面临的关键问题。去泛素化蛋白酶22(USP22)是肿瘤干细胞重要标志物之一,能够介导肝癌多药耐药的形成并可在缺氧条件下形成USP22与缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)正反馈通路来促进肝癌的肿瘤干性。靶向USP22基因治疗或可逆转肝癌肿瘤干性并增敏索拉非尼治疗。研究目的:本研究探究了肝癌组织中的USP22的表达情况及不同USP22表达量肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。合成了一种ROS响应型电荷反转聚合物B-PDEAEA来负载USP22 sh RNA(sh USP22)核酸药物,得到了不同N/P比的纳米复合物。根据纳米复合物的基因转染效率,筛选得到纳米复合物的最适N/P比。将负载有索拉非尼、表面修饰半乳糖的脂质体包裹于纳米复合物表面,制备得到索拉非尼与sh USP22共载纳米药物(Gal-SLP),并深入探究索拉非尼与sh USP22基因协同治疗肝癌效果。建立了一例索拉非尼不敏感的人源肝癌异植瘤(HCC PDX)模型,探究Gal-SLP的体内抑瘤效果及生物安全性。研究方法:第一部分:本研究通过TCGA癌症基因数据库及KM-plotter生存分析数据库对USP22在肝癌中的表达情况及其与预后的相关性进行分析。利用USP22过表达及沉默慢病毒转染构建了USP22表达量不同的Huh-7及BEL-7402肝癌细胞系,并深入研究肝癌细胞中USP22表达量对索拉非尼敏感性及肿瘤细胞糖酵解速率的影响。第二部分:本研究合成了一种ROS响应型电荷反转的阳离子聚合物B-PDEAEA,来负载核酸药物。调整载体材料与核酸药物的N/P比,制备得到了不同N/P比的纳米复合物,并根据肝癌细胞内USP22沉默效率以及绿色荧光蛋白转染效率筛选得到最适N/P比用于后续实验。通过薄膜水化法在纳米复合物表面包裹一层含索拉非尼的半乳糖修饰的脂质体,得到了具有肝癌靶向能力的索拉非尼与sh USP22共载纳米药物(Gal-SLP),并对其粒径、电荷以及索拉非尼的释放特性进行了深入的探究。第三部分:本研究对Gal-SLP在体外抑制肝癌细胞生长、增殖的能力进行检测,并探究了索拉非尼与USP22基因联合治疗是否存在协同效应。通过DHE染色对索拉非尼能否引起肿瘤细胞内ROS水平的升高进行了验证,并深入探究了ROS水平升高是否会促进ROS响应型纳米药物Gal-SLP快速释放sh USP22。对Gal-SLP沉默肝癌细胞USP22表达的能力及AKT/GSK-3β/MRP1信号通路上的蛋白表达情况进行检测,并对细胞内索拉非尼的积聚量进行测定。探究了索拉非尼及负载sh USP22纳米药物(Gal-LP及Gal-SLP)对Huh-7细胞系糖酵解速率的影响,并探讨了糖酵解抑制剂与索拉非尼联合用于肝癌治疗的可能。建立了索拉非尼不敏感的肝癌PDX模型,在该模型上对Gal-SLP的体内抑瘤效果进行探究,并进一步进行了生物安全性评价。研究结果:第一部分:TCGA数据库显示,肝癌组织的USP22表达明显高于正常肝脏组织;同时,USP22高表达的肝癌患者预后明显比低表达肝癌患者差。本研究成功构建了不同USP22表达量的肝癌细胞,发现USP22过表达会导致肝癌细胞对索拉非尼的敏感性降低,而沉默USP22则可提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。此外,USP22过表达后的Huh-7 OE细胞系的糖酵解速率明显高于对照组Huh-7 NCOE;在沉默USP22后,Huh-7 SH细胞系的糖酵解速率发生下降,低于其对照组Huh-7NCSH,提示在Huh-7细胞中,USP22的表达与糖酵解速率呈正相关。第二部分:本研究利用ROS响应型电荷反转的阳离子聚合物B-PDEAEA负载核酸药物得到粒径~40 nm、zeta电位在+20至+25 m V间的纳米复合物。纳米复合物基因负载效率高且具有良好的ROS响应性能。根据不同N/P比纳米复合物在肝癌细胞中的基因转染效率,筛选出N/P=17为最适N/P比用于后续实验。通过薄膜水化法在纳米复合物表面包裹一层含索拉非尼的半乳糖修饰的脂质体以增强纳米药物的体内循环能力及肝癌靶向性,得到了具有肝癌靶向能力的索拉非尼与sh USP22共载纳米药物(Gal-SLP)。经脂质体修饰后,Gal-SLP的zeta电位降至-5.6±0.8 m V,粒径增大至95.6±5.2 nm,分布均一。同时,Gal-SLP中负载的索拉非尼具有缓释的特点,并且在酸性环境(拟肿瘤微环境)下,索拉非尼释放速率加快。第三部分:索拉非尼与USP22基因联合治疗(Gal-SLP)在Huh-7及BEL-7402细胞系中的药物联合指数分别为0.759及0.713,展现出较强的协同效应。Gal-SLP在体外可有效抑制肝癌细胞生长、增殖。DHE染色实验及CLSM观察核酸药物释放实验结果说明索拉非尼及Gal-SLP可引起Huh-7细胞内ROS水平的升高,触发ROS响应型纳米复合物的快速解离,从而高效沉默肝癌细胞内USP22的表达。肝癌细胞内USP22表达的抑制会引起细胞膜表面多药耐药蛋白MRP1表达的下降,从而增加索拉非尼在细胞内的积聚,索拉非尼的积聚增加会进一步触发“ROS水平升高,sh USP22解离、索拉非尼积聚”的正反馈效应。sh USP22基因治疗(Gal-LP)可有效降低Huh-7细胞的糖酵解速率,同时,Gal-SLP可抵消索拉非尼可能引起的糖酵解速率升高,并揭示了糖酵解抑制剂用于索拉非尼增敏治疗的可能。本研究建立了一例索拉非尼不敏感的肝癌PDX模型,并将其用于Gal-SLP的体内药效评价,发现Gal-SLP可有效沉默肿瘤细胞的USP22表达,抑制肿瘤的生长,抑瘤率可达82.7±4.9%,远高于索拉非尼(53.4±15.5%)及Gal-LP(55.0±7.8%);同时,Gal-SLP的生物安全性良好,未造成实验动物明显的脏器损伤。研究结论:本研究构建了一种具有自激活及级联响应特性的肝癌靶向索拉非尼及sh USP22共载纳米药物(Gal-SLP)。Gal-SLP在肝癌细胞内有三重协同抗癌效应:首先,Gal-SLP释放的索拉非尼能引起细胞内ROS水平的上升,引发由氧化响应型纳米复合物的崩解,促使更多sh USP22进入细胞核,进而高效抑制USP22蛋白的表达;其次,USP22表达的下降可降低多药耐药相关蛋白MRP-1的表达,从而抑制索拉非尼向细胞外转运,造成肿瘤内索拉非尼的积聚,并进一步引发细胞内ROS水平的升高;同时,USP22表达的下降能够有效抑制肝癌细胞糖酵解的水平,从而干预肿瘤细胞代谢。Gal-SLP能有效抑制索拉非尼不敏感肝癌PDX的生长,并且具有良好的生物安全性,有较好的临床转化前景。