草莓（Fragaria×ananassa）属于蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）多年生浆果类草本植物,在世界经济作物上有着十分重要的作用。近年来,中国草莓生产发展很快,栽培规模与产量均居于全球首位。草莓中含有大量膳食纤维和果胶,能够提高胃肠道的蠕动,从而促进消化吸收。但在生产过程中,草莓会遭受许多病害的侵染,其中草莓炭疽病的危害较为严重。南方地区高温多雨,草莓极易感染炭疽病。染病后草莓叶片可产生局部病斑,进而逐步扩大,致使整株凋零枯死,可在短时间内对草莓产业造成毁灭性的损失。中国是世界上野生草莓资源最丰富的国家,多项研究表明,野生黄毛草莓（Fragaria nilgerrensis）对炭疽病的抗性较强。从野生草莓中挖掘抗病基因,结合传统杂交育种手段,培育新的种质资源,为实现草莓抗性育种提供更快捷的手段。课题组前期以黄毛草莓为试验材料,在胶孢炭疽菌（Colletotrichum gleosporiodes）诱导下进行转录组差异表达分析,筛选出受胶孢炭疽菌诱导表达上调的NLR基因FnNLR,本研究首先克隆了该基因的cDNA序列（Gen Bank登录号:OM909008）。在此基础上,分析其基因结构;构建FnNLR基因过表达载体,通过对森林草莓（F.vesca）‘Hawaii 4’进行遗传转化,分析其抗炭疽病功能;通过酵母双杂交获得FnNLR互作蛋白,进一步探索其抗病机制。取得了如下主要结果:1、采用同源克隆技术从黄毛草莓中获得FnNLR基因的cDNA序列,其开放阅读框长度为1749 bp,编码582个氨基酸,具有一个N端的RPW8结构域、中间结构域NB-ARC和C端的LRR保守结构域。实时荧光定量PCR结果显示,NLR基因在抗病的黄毛草莓和感病栽培品种‘妙香3号’草莓中均受胶孢炭疽菌和水杨酸（SA）诱导,且在黄毛草莓中的表达量明显高于‘妙香3号’草莓。2、构建了植物过表达载体pCAMBIA1300-HA-FnNLR,转化到农杆菌菌株GV3101中,再通过花絮浸染法转化拟南芥。对FnNLR转基因拟南芥进行病原菌接种处理,初步分析了FnNLR的抗病功能。转FnNLR转基因拟南芥接种希金斯炭疽菌（C.higginsanum）后,与野生型（WT）拟南芥相比,转FnNLR基因拟南芥株系的病斑面积更小,细胞死亡和超氧阴离子(O2-)积累更多。表型鉴定结果表明,转FnNLR基因拟南芥增强了对希金斯炭疽菌的抗性。进一步通过荧光定量PCR检测不同抗病信号转导途径中相关防御基因的表达量,结果显示,转基因株系中的AtPR1、AtICS1、AtPDF1.2和AtLOX3相对表达量均显著高于野生型;接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas sringae pv.tomato,DC3000）后,转基因拟南芥叶片的细菌数量低于野生型。qRT-PCR结果显示转基因拟南芥中的AtPR1、AtICS1、AtPDF1.2和AtLOX3相对表达量也高于野生型。以上结果表明,FnNLR基因在植物抵御病原菌入侵过程中可能发挥重要作用。3、将构建的植物过表达载体转化到农杆菌菌株EHA105中,再通过农杆菌介导的叶盘法遗传转化森林草莓‘Hawaii 4’。通过DNA、RNA和蛋白水平共鉴定到11株阳性转基因植株。对转基因株系和野生型（WT）接种了胶孢炭疽菌处理,发现转基因株系的发病面积显著小于野生型,表型鉴定结果表明,转FnNLR基因草莓株系增强了对草莓胶孢炭疽菌的抗性。接种炭疽菌不同时期转基因株系抗氧化酶CAT、POD和SOD活性均高于野生型,且转基因株系和野生型相比,SA和JA信号途径防御相关基因FvPR1和FvPR5,FvCOI1和FvJAZ1均被显著诱导上调表达,表明FnNLR可能通过调控上述基因表达参与调控草莓炭疽病的抗性。4、选取最抗胶孢炭疽菌的转基因草莓株系OE-1和野生型草莓植株分别进行接种胶孢炭疽菌处理,在0和12 h时采集样品进行转录组分析。转基因株系未接种炭疽菌（OE2C）与野生型未接种（WTC）相比,共有差异表达基因715个,其中有538个上调基因,177个下调基因。结果表明未接种时转基因株系有许多差异表达基因本底就已经上调表达。通过GO功能富集和KEGG富集分析发现,转基因株系中次生物质的生物合成、植物激素信号转导等途径的相关基因在本底水平就已经被加强表达,表明FnNLR基因可能通过激活调控次生物质的生物合成、植物激素信号转导等途径来调控对炭疽菌的抗性。随后对差异表达转录因子和抗病相关基因进行分析,结果表明转FnNLR基因草莓植株中的MYB、AP2、WRKY等转录因子和抗病相关基因NB-ARC的表达增强,参与调控下游相关信号途径。5、将转基因株系OE-1和野生型森林草莓均在接种胶孢炭疽菌0和12 h取样进行代谢组学分析,发现转基因株系未接种胶孢炭疽菌（OE2C）和接种12 h（OE2T）时检测出的显著性差异代谢物共686种,其中以脂质和黄酮及其衍生物的占比最大。KEGG富集分析结果表明转基因株系在“类黄酮合成”“苯丙氨酸代谢”和“苯丙烷生物合成”途径均有差异代谢物富集。进一步将转录组和代谢组结合分析,发现转基因株系中“类黄酮生物合成”和“苯丙烷生物合成”代谢通路中的一些关键基因本底表达加强,代谢物积累。6、构建了FnNLR酵母双杂交BD载体,通过自激活检测证明pGBKT7-FnNLR在Y2H Gold酵母菌株中没有自激活活性。将BD载体pGBKT7-FnNLR与酵母文库共转化Y2H Gold后在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-gal（TDO/X）培养基上初步筛选到100个阳性克隆,接着在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/Ab A（QDO/X/A）培养基平板上筛选培养,复筛到59个阳性克隆,随机挑选30个进行PCR测序,再从测序正确的单克隆中挑取10个与抗病相关的基因分别进行一对一验证,检测出9个阳性基因,再对其进行点板验证,最终筛选到4个FnNLR下游互作蛋白,分别是泛素化结合酶E2、主要过敏原Pruar1蛋白PR10-1、木质素合成相关蛋白FvDIR1、血红素结合蛋白SOUL2。上述蛋白在植物中均参与调控病菌抗性,我们推测黄毛草莓FnNLR可能通过与上述蛋白互作调控草莓抗炭疽病。