长江江豚（Neophocaena asiaeorientalis）主要栖息于长江中下游干流、洞庭湖和鄱阳湖及支流尾闾。近几十年来,随着长江流域社会经济迅猛发展,人类活动强度激增,导致水域生态环境不断恶化,水生生物资源严重衰退,作为长江生态系统健康与否的重要指示物种,长江江豚仅剩千余头,种群极度濒危。作为水生哺乳动物,长江江豚长期暴露于水体中各种环境污染物和病原微生物等风险胁迫之下,免疫系统面临着诸多挑战,而关于其免疫系统特征及免疫适应性机制尚不清楚。血液分析是监测、评估水生野生动物健康和生理状况的基本手段,通过对血液中转录物丰度的分析,可以有效监测其免疫水平,获取丰富的免疫反应相关基因和通路。本研究采集了不同年龄、性别和栖息生境的长江江豚血液样本,对生理生化指标进行比较分析;采用RNA-Seq技术构建血液转录组文库并进行测序分析,揭示长江江豚血液基因的表达模式和差异表达水平,阐述差异表达基因所主导的免疫适应性。此外,长江江豚具有独特的进化历史,其祖先从陆地重返海洋,再从海洋进入淡水,在此过程中复杂的水生环境是否驱动了免疫基因的进化与适应尚不得而知。本研究以补体基因家族（Complement）为切入点,结合生物信息学分析,从序列水平探究补体基因家族的进化模式,以期为全面理解长江江豚的免疫系统及其在多样环境中的适应性提供基础资料。本论文主要研究结果如下:1.从长江下游安徽段自然和迁地水域共采集了46头健康长江江豚的血液样本,根据年龄、性别和栖息生境分组对血常规、血生化和血清免疫指标进行比较分析。在年龄方面,长江江豚青年和中老年组红细胞、血红蛋白和碱性磷酸酶等指标值均显著低于幼年组（P＜0.05）;中老年组淋巴细胞和中性粒细胞等指标值显著低于幼年组（P＜0.05）,而总胆红素和白蛋白值则显著高于幼年组（P＜0.05）;青年组嗜酸性粒细胞指标值显著高于中老年组（P＜0.05）。在性别方面,雄性长江江豚白细胞、中性粒细胞和总蛋白等指标值较高（P＜0.05）,而雌性平均血红蛋白量值更高（P＜0.05）。在生境方面,栖息于自然水域长江江豚的淋巴细胞、球蛋白、γ-谷氨酰基转移酶、尿酸、甘油三酯、TNF-α和IL-6等指标值较高（P＜0.05）,而迁地保护水域长江江豚的红细胞、血红蛋白、血细胞压积、平均血红蛋白浓度、二氧化碳等指标值更高（P＜0.05）。这些研究结果表明长江江豚血常规、血生化和血清免疫指标受到年龄、性别和栖息生境的影响。2.利用BGISEQ-500测序平台对9头不同年龄阶段长江江豚的血液组织（幼年、青年和中老年各3头）进行mRNA和micro RNA测序和分析。从9个样本中共获得了6.23亿条clean reads,进一步组装成15904个unigenes,占基因组注释基因总数的72.2%。在中老年vs青年比较组中,有74个上调基因和821个下调基因,青年组与先天和适应性免疫系统相关基因的表达量更高,包括补体成分、主要组织相容性复合体、白细胞介素、TNF受体、趋化因子和细胞因子等。在中老年vs幼年比较组中,有135个上调基因和879个下调基因,幼年组与先天性免疫系统相关基因的表达量更高且“Toll样受体信号通路”被显著富集。在青年vs幼年比较组中,有195个上调基因和220个下调基因,青年组与适应性免疫和“Fox O信号通路”相关基因表达量较高,而与“PI3K-Akt信号通路”相关基因表达量较低。通过miRNA筛选,共检测到478个保守miRNA和576个新预测miRNA。差异表达分析共获得了545个差异表达miRNAs（DEMs）,在中老年vs青年、中老年vs幼年和青年vs幼年比较组中,分别有81、94和122个DEMs上调,92、80和76个DEMs下调。基于DEGs和DEMs的联合分析,在3个比较组中分别预测了326、316和211对miRNA-mRNA负调控关系。研究表明,长江江豚的先天免疫在早期具有明显优势,而适应性免疫随着年龄增长先增强后衰退,且miRNAs表达谱变化与年龄对免疫功能的影响相关。3.以3头雌性和3头雄性长江江豚血液为实验样本进行mRNA和micro RNA测序。从6个样本中共获得了4.74亿条clean reads,进一步组装成15878个unigenes,占基因组注释基因总数的72.1%。KEGG分析发现有1534个unigenes注释到免疫系统相关类别并显著富集于20个常见免疫通路。将不同性别长江江豚血液转录组进行比较,鉴定了539个差异表达基因（DEGs）,其中有299个是雌偏好表达基因,240个是雄偏好表达基因。GO和KEGG富集分析显示,雌豚血液基因与能量代谢功能显著相关,而雄豚与细胞生长功能显著相关。此外,通路富集分析还发现了Fox O和Hippo两条免疫相关信号通路在雌性江豚血液中被激活。通过miRNA筛选,共检测到457个保守miRNA和528个新预测miRNA。差异表达分析共获得了160个差异表达miRNAs（DEMs）,其中有97个DEMs在雌性江豚中上调表达,63个DEMs在雄性江豚中上调表达。基于DEGs和DEMs的联合分析,预测了45对miRNA-mRNA负调控关系,包括13个DEMs和对应靶向关系的37个免疫相关DEGs。研究表明,雌性江豚可能具有更强的免疫力及维持机体内稳态的能力,且micro RNAs通过调控基因表达参与江豚两性免疫系统。4.以3头采集于自然水域和3头采集于迁地保护水域长江江豚血液为实验样本进行mRNA和micro RNA测序。从6个样本中共获得了4.24亿条clean reads,进一步组装成15760个unigenes,占基因组注释基因总数的71.6%。KEGG分析发现有1527个unigenes注释到免疫系统相关类别并鉴定了103个重要的免疫相关基因。将两种生境血液转录组进行比较,鉴定了1051个差异表达基因（DEGs）,其中有745个在自然水域呈上调表达,306个在迁地保护水域呈上调表达。差异表达基因功能分析发现有40个DEGs富集到免疫通路,且大部分呈上调表达。通路富集分析发现差异表达基因显著富集于7条免疫相关通路,其中“补体与凝血级联”通路富集程度最高。通过miRNA筛选,共检测到468个保守miRNA和576个新预测miRNA。差异表达分析共获得了189个差异表达的miRNAs（DEMs）,其中有75个DEMs在自然水域江豚中上调表达,114个DEMs在迁地保护水域江豚中上调表达。基于DEGs和DEMs的联合分析,预测了46对miRNA-mRNA负调控关系,包括18个DEMs和对应靶向关系的43个免疫相关DEGs。研究表明生活于自然水域江豚可能具有更强的免疫力,且micro RNAs可以通过调控基因表达参与江豚对不同生境的免疫适应过程。5.从长江江豚基因组中共鉴定了52个补体基因,包括8个模式识别基因,15个蛋白酶基因,12个补体成分基因,6个受体基因,以及11个调控基因。许多补体基因进化成多拷贝,结合这些基因在染色体上的位置,提示串联复制可能是基因拷贝数多的原因。补体基因随机分布在20条染色体片段上,内含子数量从1到41不等。对18种代表性哺乳动物进行了系统发育分析,发现各补体基因分支中鲸类动物与其他哺乳动物各聚为一支,长江江豚与鲸类动物聚为一支,均符合物种进化地位。此外,各补体基因均与同源基因聚为一支,表明它们在进化过程中高度保守。位点模型分析发现C3、C4、C5、C6、C8、C9和CR2基因均受到了正选择作用,表明补体基因在哺乳动物进化历程中发生了适应性进化。另外,分枝模型和分枝位点模型分析发现C4、C7和C9基因在长江江豚进化枝系上受到正选择作用,表明长江江豚补体基因家族发生了从陆生到水生的适应性进化。本研究通过生理生化指标和血液转录组从年龄、性别和栖息生境三个维度对长江江豚生理生化水平和基因表达调控机制进行探讨,为掌握长江江豚的免疫系统提供基础资料。另一方面,对重要的先天性免疫基因家族Complement进行了分子进化分析,为解析长江江豚免疫适应性进化模式奠定基础。本研究为从免疫角度阐释长江江豚在不同年龄和性别影响下的生理变化以及对多样生境的适应能力提供了新视角,同时为长江江豚保护提供了参考借鉴。