红细胞生成素(erythropoietin , EPO)是一种刺激红细胞生成的糖蛋白激素,产生于肾脏,循环于血液中,作用于骨髓,刺激红细胞的生成。重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin, rHuEPO)是利用基因工程技术,将人的EPO基因转入哺乳动物细胞内,高效表达的糖蛋白,由165个氨基酸组成。用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗产生的贫血。自1989年rHuEPO上市以来,rHuEPO一直是全球销售额最大的生物技术药品,每年年销售额超过百亿美元。rHuEPO给全球相关病症的患者带来福音,使用rHuEPO可以减少输血次数,提高生活品质。但rHuEPO体内半衰期仅为4~8h,需要每周至少给药2~3次,一个疗程至少需8周,病人需长期用药。频繁注射给患者带来很多不便和痛苦,降低了病人的依从性。全球多家研究机构正致力于长效人红细胞生成素的研究来克服rHuEPO体内半衰期短的缺点。研究主要分三个方向。第一、增加rHuEPO糖链数量和糖基化程度。主要产品有美国AMGEN公司的Aranesp。第二、对rHuEPO进行体外PEG化修饰。主要产品有瑞士Roche公司的MIRCERA。第三、用基因重组技术形成EPO多聚体或在EPO氨基酸链连接大分子蛋白质或多肽形成EPO融合蛋白。主要产品有EPO-Fc。目前,已有几种产品获准上市。我们将这类能延长EPO的体内半衰期的产品统称为长效红细胞生成素。IgG类免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质,其Fc片段的半衰期可达21天。利用DNA重组技术,将人IgG的Fc基因片段与EPO基因重组,通过CHO细胞表达生产长效重组人红细胞生成素-Fc融合蛋白(EPO-Fc),其应具有rHuEPO的疗效,又有Fc片段半衰期长的特点。以此思路,本研究在获得表达EPO-Fc融合蛋白的CHO细胞株的基础上,进行了对该细胞株的安全性和稳定性评价研究。由于所表达的EPO-Fc融合蛋白是非天然蛋白质,本研究对其理化性质、生物学活性及免疫原性等进行了深入研究。建立了一套完善的产品质量控制体系和多种生物学活性方法,并对EPO-Fc融合蛋白的长效性进行了初步研究。结果表明:表达EPO-Fc融合蛋白的工程细胞株安全性和稳定性以及EPO-Fc融合蛋白的质量均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005年版)的要求。生物学活性方法结果可靠,重复性好。EPO-Fc融合蛋白的各项理化、生物学特征得到确认。EPO-Fc融合蛋白免疫原性研究表明:恒河猴皮下注射给药,当给药时间达到16周时,绝大多数受试恒河猴产生抗体和中和抗体。恢复期间,抗体滴度显著下降,至恢复8周时,部分恒河猴的抗体和中和抗体已恢复至正常水平。全人源化EPO-Fc对于恒河猴而言是一种外源性蛋白,具有一定的免疫原性;但其对于人体则是一种安全的内源性因子,具有良好的临床应用前景。本研究首次全面揭示了EPO-Fc融合蛋白的理化、生物学特征。对表达EPO-Fc融合蛋白的工程细胞株安全性和稳定性的全面鉴定表明工程细胞株符合重组技术药物的生产的相关标准。第一次建立了一套完善的EPO-Fc融合蛋白产品质量控制体系和多种生物学活性方法。建立了EPO-Fc融合蛋白参考品。确定EPO-Fc融合蛋白具有免疫原性的特点,需在临床上继续观察。