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信号转导通路在不同细胞体系的发育中具有重要但又互不相同的调控作用。MKK4和MKK7是MAPK的上游激酶通路,是介导生理或者病理条件下细胞生物学应答的重要信号系统。这两个激酶对于胎鼠的发育存活具有重要作用,但由于其基因敲除的胚胎致死性,他们在发育过程中的精确调控机制还不清楚。胚胎干细胞的体外分化模型为研究胚胎致死性基因在体内发育过程中细胞特异性和阶段特异性的作用提供了有效的载体。通过使用胚胎干细胞体外分化的模型结合MKK4和MKK7基因敲除的鼠科类胚胎干细胞,我们探讨了MKK4和MKK7在体外分化过程中的重要作用。MKK4和MKK7在干细胞的自我增殖更新和维持干细胞的特性中无特异性作用,但是在不同细胞体系的分化中具有不同的调控作用。首先,我们成功建立了胚胎干细胞向心肌细胞和神经细胞分化的模型。在心肌细胞分化的研究中,我们发现通过拟胚体(EBs)的形成,干细胞可以分化为内,中,外三个胚层的细胞,其中大部分分化为中胚层细胞,在分化的中胚层细胞中又有大部分细胞属于心肌细胞。在心肌细胞分化研究中我们发现,一方面,MKK4和MKK7通过MAPKK-MAPK模式共同激活JNK-cJUN信号通路,MKK4和MKK7的双重敲除导致JNK-cJUN信号通路的失活从而引起分化细胞的老化。另一方面,在分化过程中,MKK4和MKK7对于p38通路的磷酸化活化具有相反的调控作用。MKK7减少p38的磷酸化活化,具体表现在MKK7基因敲除的干细胞分化过程中,磷酸化的MKK4,p38和ATF2表达量增加,同时Mef2c的基因表达增加。从而引起MKK7基因敲除分化的干细胞中Mhc和Mlc的基因表达量同时收缩性心肌细胞的形成增加。与此相反,MKK4在干细胞分化过程中增加p38的磷酸化活化,所以MKK4基因敲除的分化的干细胞中磷酸化的ATF2和Mef2c的基因表达量减少,同时引起Mhc表达量的减少和心肌细胞发育的缺陷。外源性表达的MKK4部分上修复了MKK4基因敲除细胞心肌细胞发育的缺陷,从而进一步证实了MKK4在心肌细胞发育中的重要作用。我们的研究提示了MKK4和MKK7在早期发育过程中相互依存又互不相同的作用,同时证实了MKK4在p38的激活和心肌发育中的重要调控作用。此外,环境中很多因子可以通过影响MKK4和MKK7信号通路导致发育毒性。我们发现非细胞毒性的双酚A(Bisphenol-A)和镍(Nickel)都有很强的心脏发育的毒性, MKK7基因敲除的细胞可以代偿双酚A引起的心肌发育毒性,表明MKK7在双酚A引起的心肌发育毒性中有重要作用。一、MKK4和MKK7在心肌细胞分化过程中不同的调控作用(一)目的探讨MKK4和MKK7及其下游MAPK信号转导通路在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的作用。(二)方法通过western blotting和免疫荧光染色检测心肌细胞分化过程中MAPK信号转导通路蛋白的表达水平。在干细胞分化的不同时期,通过real-time PCR检测心肌特异性基因的表达水平。在心肌细胞分化过程中,检测p38丝裂原活化激酶的磷酸化水平,并使用其特异性抑制剂SB202190探讨p38MAPK信号转导通路在心肌细胞分化过程中的作用。在MKK4基因敲除的干细胞中通过建立稳定细胞系修复MKK4的表达。通过GST-pull down和体外激酶活性测定探讨MKK4-p38的相互作用。通过染色体免疫共沉淀检测不同转录因子对MHC基因表达不同的调控作用。(三)结果我们建立了胚胎干细胞向内胚层、中胚层、外胚层细胞分化的体外分化模型。结合胚胎干细胞体外分化模型及不同的MAP2Ks基因敲除细胞,我们发现了MKK4-p38-ATF2和MKK4/7-JNK-c-JUN信号转导通路在干细胞分化过程中不同的调控作用。首先,我们发现MKK4/7-JNK-c-JUN信号通路在分化细胞存活中的重要作用；其次,我们发现MKK4-p38信号通路激活过程中新的分子机制研究及MKK4-p38信号通路在MHC基因表达及心肌细胞分化过程中的调控作用；同时,我们还发现MKK7通过与MKK4-p38相互作用降低体外分化过程中的心肌形成。这一研究揭示了分化发育过程中一个新的分子信号机制。(四)结论基于这些数据,我们提出MKK4和MKK7在干细胞分化过程中具有互相补充又互不相同的作用。MAPKs信号转导通路在发育过程中的分子信号机制可以通过干细胞体外分化模型检测和评估。二、MKK7在环境因子导致的心肌发育毒性中的作用(一)目的评估MAPK信号转导通路在环境因子导致的心肌发育毒性中的作用。(二)方法在干细胞体外分化过程中,我们用非细胞毒性的不同的环境因子处理细胞。然后显微镜下观察跳动性心肌的形成同时通过real-time PCR检测不同的基因表达评估其心肌发育毒性。为了探讨双酚A和雌激素是否通过雌激素受体介导心肌发育毒性,我们在双酚A和雌激素处理过程中同时使用雌激素受体的特异性抑制剂ICI182,780来处理细胞。(三)结果用不同的环境因子处理分化过程中的干细胞,镍在野生型和Mkk7(-/-)细胞中都可以100%抑制跳动性心肌细胞形成,表明其强的心肌毒性。有趣的是,双酚A和雌激素在野生型细胞中可以完全抑制跳动性心肌细胞的形成,但是Mkk7(-/-)细胞可以完全代偿双酚A和雌激素引起的心肌毒性。这一观察表明双酚A和雌激素主要通过MKK7介导心肌毒性。雌激素受体特异性抑制剂不能缓解这一表现型,表明双酚A和雌激素通过非雌激素受体依赖性的方式介导心肌发育毒性。(四)结论基于这些数据,我们指出环境因子刺激可以激活MAPK信号转导通路进而调控心肌发育。MKK7可能介导双酚A引起的心肌毒性。统计学处理用SPSS13.0软件,对实验数据进行处理,采用单因素方差分析Dunnett进行统计分析,P<0.05具有统计学意义。