1981年,Bill Stallcup小组在研究神经细胞表面抗原时,鉴定出一种介于纯粹的神经元和神经胶质特性中间的细胞系,具有神经元和神经胶质交叉活性(NG1和NG2),NG代表(neuron/glial)神经元和神经胶质。近年的研究结果发现,在发育和成熟的中枢神经系统中存在一类新的细胞群——NG2细胞,他们不同于神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞,在其细胞表面特异性的表达NG2蛋白多糖。NG2是一种硫酸软骨素蛋白多糖( chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG),是由2327个氨基酸构成的一种330kD高分子量的Ⅰ型跨膜蛋白[1,2]。NG2细胞最初被认为是少突胶质细胞的前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPC),后来使用新转基因小鼠的研究发现,NG2细胞在体内不仅能够生成少突胶质细胞,而且还能产生原浆性星形胶质细胞[3],以及某些情况下的神经元[4],推测其可能是一种神经前体细胞[5]。NG2细胞除了广泛分布于发育和成熟的中枢神经系统,许多间充质细胞也表达NG2蛋白多糖,比如未成熟的成软骨细胞[6],未成熟的平滑肌细胞,发育的骨骼肌和骨,骨骼肌成肌细胞[7],表皮干细胞,人类黑色素瘤细胞,大血管的平滑肌细胞,微血管的周细胞[8]。目前报道NG2细胞的功能特性有:分化和迁移能力;自我更新和不均一分裂的能力[9];与神经元形成兴奋性或抑制性的突触联系[10,11];记录到长时程增强(long-term potentiation,LTP),可能在突触可塑性方面有重要功能[12]。对于NG2细胞的功能和意义目前了解的还不是很清楚,许多问题还有待进一步深入的研究。Visfatin/Nampt是一个分子量为52 kDa的蛋白质,含491个氨基酸,它是生命活动中十分重要的蛋白分子。根据其先后被发现的功能而命名为前B细胞克隆增强因子(pre-B cell colony-enhancing factor,PBEF),内脏脂肪分泌的脂肪细胞因子visfatin,哺乳动物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)合成的限速酶——烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)。Visfatin在体内分布范围很广,并不局限于内脏脂肪组织,在生物体内的主要表达器官和组织有内脏脂肪、血液有核细胞、肝组织、脑、心、脾、胰、肌肉、骨髓、肺[13]。Visfatin具有广泛的生物学功能。首先,它控制着NAD的合成,极大地调控了生物体的各种生物学功能。此外,它还能促进细胞增殖、参与炎性应答、调节细胞分化[14]、抗细胞凋亡[15]、促进血管新生[16]、参与细胞周期,调控胰岛素分泌[17]等等。我们已经证实visfatin大量表达在脑组织,而且,在缺血性脑卒中时visfatin在梗死半影区和梗死中心区表达显著上调。使用FK866抑制visfatin后,脑缺血再灌注后脑梗死面积扩大。而加入烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)或者过表达visfatin ,可以减少脑缺血再灌注损伤后脑梗死面积,表明visfatin在缺血性脑卒中时是一种重要的保护因子。已有文献报道,在大鼠脑缺血再灌注损伤后,梗死周围半影区内的NG2细胞增加,有可能分化为少突胶质细胞作为髓鞘再生细胞的来源,还有可能通过其他途径参与缺血损伤后的脑组织的再生及修复过程[18]。目前,没有任何关于visfatin对于NG2细胞增殖能力是否有调节作用的报道,也没有关于NG2细胞在遗传性脑卒中模型——易卒中型高血压大鼠(Stroke-prone spontaneously hypertensive rats,SHR-SP)上研究的报道。本课题针对visfatin在大脑中的作用,尤其是对脑缺血损伤后NG2细胞的增殖进行了研究,此外,研究了NG2细胞在遗传性脑卒中模型SHR-SP上的特点,以及visfatin对其的影响作用。我们试图寻找一种能够引起NG2细胞增殖的激活因子,参与脑损伤的神经修复和功能恢复,从而在脑卒中神经再生中发挥作用。具体实验如下:第一部分:我们首先建立了局灶性脑缺血动物模型——线栓法制备的大鼠局灶性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。我们在模型的制备过程中,对实验条件进行了严格的控制,比如:大鼠的体重、栓线的制备、麻醉、手术操作和室温,对动物的生理参数:血压、血气、直肠温度进行了监测并使其保持恒定,在激光多普勒血流仪的辅助下提高了模型的成功率,最后通过神经行为学评分和TTC染色判断模型制备的成功率和梗死体积。根据我们的标准操作规程,建立了稳定的大脑中动脉阻塞模型,为后续实验的进行做好了准备。第二部分:我们主要探讨了visfatin对脑缺血损伤后NG2细胞的影响。我们已经确认visfatin在脑组织中确实有表达。先前预实验中,给正常大鼠饮水口服visfatin特异性酶抑制剂——FK866 (1 mg/kg/day),没有发现大鼠有任何异常的行为改变。治疗组大鼠进行FK866饮水治疗2周,抑制visfatin,脑片进行免疫荧光染色检测发现,假手术组未发现大脑中NG2细胞有任何改变,因此,我们得出FK866抑制visfatin后,对正常大鼠大脑内的NG2细胞没有影响;在脑缺血再灌注损伤后,结果发现梗死半影区的NG2细胞依然显著增生,visfatin被FK866抑制后,没有影响到半影区NG2细胞的增殖,梗死中心区和对侧区的NG2细胞与对照组相比也没有差别。我们的实验结果表明,visfatin无论是对正常大脑内的NG2细胞,还是脑缺血损伤后不同区域的NG2细胞变化都没有产生作用。第三部分:我们对遗传性脑卒中模型SHR-SP上的NG2细胞进行了检测。实验结果发现6月龄的SHR-SP较WKY相比NG2细胞数显著减少,但是3月龄SHR-SP与WKY之间没有差别,显然脑内NG2细胞数目和SHR-SP的鼠龄有关。6月龄SHR-SP大脑内NG2细胞数显著减少,与先前报道SHR-SP出现脱髓鞘改变,提示其出现脱髓鞘损伤可能和NG2细胞数目的减少有关。有关NG2细胞改变和SHR-SP易发脑卒中之间的联系,我们已经在进一步的研究中。第四部分:Visfatin对遗传性脑卒中模型SHR-SP上NG2细胞的作用。SHR-SP从6月龄起饮水口服FK866,因脑卒中发病而死亡的时间明显提前,说明visfatin被FK866抑制后,脑卒中的发生加快了,暗示visfatin可能有一定的神经保护作用。接下来,我们对6月龄SHR-SP给予FK866饮水两周后,脑内NG2细胞与对照组相比没有发现明显的差别;同样,在3月龄WKY和SHR-SP上,也未发现有改变。因此,根据我们的实验结果,visfatin对遗传性脑卒中模型SHR-SP大脑内NG2细胞没有作用。结论:在本论文中,我们首次检测了不管是在正常的大鼠,还是实验性局灶性脑缺血模型——MCAO模型,以及遗传性脑卒中模型SHR-SP上,都没有发现visfatin对NG2细胞的作用,据目前的实验结果来看两者之间没有关联。使用FK866抑制visfatin后,6月龄SHR-SP脑卒中发生加快,提示visfatin可能有一定的神经保护作用,具体机制还在研究中。我们在6月龄SHR-SP上发现其大脑内NG2细胞数目减少,推测这可能是脑卒中易发的诱发因素,目前我们正在研究他们之间的联系。