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NX毒素是镰刀菌属（Fusarium spp.）产生的一种新发现的真菌毒素,属于A型单端孢霉烯类毒素（Trichothecenes,TS）。TS可分为A、B、C、D 四种类型,自然界广泛污染的TS大多属于A型和B型。TS广泛存在于粮食作物中,一旦被人类和动物摄入,会引起各种急、慢性中毒症状,其中拒食反应是最直接的中毒表现。虽然有一些研究已经证实了 4种A型TS（T-2、HT-2、DAS和NEO）能够引起人和动物的拒食反应,并且阐明了其诱导拒食的部分机理,但是NX毒素是最近才发现的真菌毒素,人们对其毒性研究还很少,对于NX毒素能否诱导拒食反应,以及引起拒食反应的强度以及机理尚不清楚。乳酸菌具有促进食欲,增强肠道屏障保护功能,改善肠道健康,增强机体免疫力的作用。但乳酸菌能否缓解由NX毒素诱导的急性拒食反应,以及乳酸菌治疗拒食反应的机理还未见相关报道。本文以NX毒素和植物乳杆菌P-8为主要研究对象,以课题组已建立的“小鼠急性拒食方法”为试验模型,从调控食欲的脑肠肽和炎性细胞因子入手,通过ELISA检测方法和Real-Time PCR技术研究NX毒素诱导拒食的机理以及植物乳杆菌P-8对拒食的缓解作用。其中脑肠肽包括SP、CCK、GLP-1、NT、GIP、PYY3-36和Ghrelin;细胞因子包括IL-6、IL-1β和TNF-α。试验Ⅰ NX毒素诱导小鼠拒食反应的机理研究1.NX毒素诱导拒食反应的量效关系本试验将剂量分别为0、0.01、0.1、0.5和1 mg·kg-1·bw的NX毒素小鼠进行灌胃攻毒,并在攻毒后的0.5 h、1h、2 h、3 h、6 h和24 h测定小鼠的采食量。结果显示:NX毒素可以诱导小鼠产生拒食反应,且拒食反应可以在0.5 h内迅速发生,一直持续到3h,6h后恢复到基础水平,当NX毒素的浓度为1 mg·kg-1·bw时,拒食效果最为显著。2.NX毒素诱导拒食反应与脑肠肽的关系本试验以上述试验结果为基础,将剂量为1 mg·kg-1·bw的NX毒素对小鼠进行灌胃攻毒,并在攻毒后的0h、0.5 h、2 h和6 h后收集小鼠血液、下丘脑和肠道,用ELISA检测方法测定小鼠血浆中脑肠肽浓度的变化,RT-PCR技术测定下丘脑和肠道中脑肠肽mRNA表达水平。ELISA结果显示:NX毒素能够显著上调血浆中脑肠肽CCK和NT的浓度,对脑肠肽PYY和GLP-1的影响不大。RT-PCR结果显示:下丘脑中的CCK和肠道中的NT的mRNA水平变化趋势与ELISA结果一致,在攻毒后0.5 h或2 h出现显著上调,此外,肠道中的GIP和SP的mRNA表达水平均出现显著上调。由此可见,NX毒素攻毒能够引起小鼠某些脑肠肽mRNA表达水平和蛋白浓度的显著上升,且上升的趋势和与NX毒素诱导的拒食反应呈正相关。3.NX毒素诱导拒食反应与细胞因子的关系本试验将NX毒素通过灌胃的方法对小鼠进行攻毒,攻毒的剂量为1 mg·kg-1·bw,并在攻毒后的0h、0.5 h、2 h和6 h后采集小鼠肝脏、脾脏、下丘脑和肠道,用RT-PCR技术检测NX毒素攻毒后小鼠肝脏、脾脏、下丘脑和肠道中炎性细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平。结果表明:NX毒素能够显著提高攻毒小鼠肝脏、脾脏、下丘脑和肠道中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平,且基因的上调趋势与NX毒素诱导的拒食反应一致,说明炎性细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β在NX毒素诱导的急性拒食反应中发挥作用。试验Ⅱ 植物乳杆菌P-8对NX毒素诱导拒食的缓解作用1.植物乳杆菌P-8对NX毒素诱导拒食的调节效果本试验对象为30只雌性B6C3F1小鼠,随机分为5个组,每个组6只小鼠,分别是“生理盐水对照组”;植物乳杆菌P-8组（高剂量）;“植物乳杆菌P-8（高剂量）+NX毒素组”;“植物乳杆菌P-8（低剂量）+NX毒素组”;“NX毒素组”。给小鼠灌胃植物乳杆菌P-8,剂量分别为4.6x105 cfu/μl（低剂量）和4.6x106cfu/μl（高剂量）,连续灌胃21 d,随后将NX毒素通过灌胃的方式对小鼠进行攻毒,剂量为1 mg·kg-1·bw,并在攻毒后0.5 h、1 h、2 h、3 h、6 h和24 h测定小鼠采食量。结果显示:剂量为4.6x106 cfu/μl的乳酸菌缓解拒食效果最好。2.植物乳杆菌P-8缓解拒食与脑肠肽的关系本试验以上述试验结果为基础,给小鼠连续21 d灌胃浓度为4.6x106 cfu/μl的植物乳酸杆菌P-8,随后将剂量为1 mg·kg-1·bw的NX毒素对小鼠进行灌胃攻毒,攻毒后0h、0.5 h、2 h和6 h采集小鼠血液、下丘脑和肠道,用ELISA检测方法测定小鼠血浆中脑肠肽浓度的变化;RT-PCR法测定下丘脑和肠道中脑肠肽mRNA表达水平。结果显示:植物乳杆菌P-8可以从基因水平和蛋白水平减轻NX毒素引起小鼠脑肠肽CCK、NT和SP的显著升高。3.植物乳杆菌P-8缓解拒食与细胞因子的关系本试验先给小鼠连续21 d灌胃浓度为4.6x106 cfu/μl的植物乳酸杆菌P-8,随后将剂量为1 mg·kg-1·bw的NX毒素对小鼠进行灌胃攻毒,攻毒后0 h、0.5 h、2 h和6 h采集小鼠肝脏、脾脏、下丘脑和肠道,用RT-PCR技术检测NX毒素攻毒后小鼠肝脏、脾脏、下丘脑和肠道中细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平。结果显示:用植物乳杆菌P-8灌胃再攻毒的小鼠较毒素组小鼠肝脏、脾脏、下丘脑和肠道炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平显著下降,说明植物乳杆菌P-8能够通过降低炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的基因水平缓解NX毒素诱导拒食的作用。