根霉转化坎利酮中试工艺条件研究

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11α-羟基坎利酮是坎利酮羟基化反应后形成的甾体类衍生物,也是合成依普利酮的重要药物中间体。在由甾体化合物坎利酮半化学合成依普利酮的过程中,坎利酮经微生物转化11α-羟基化是首要步骤,也是最关键的步骤之一。微生物转化坎利酮合成11α-羟基坎利酮的方法具有反应条件温和、特异性强、产率高、副产物少等特点,能克服化学合成法的不足。   本课题主要对坎利酮经根霉转化制备11α-羟基坎利酮的中试工艺条件进行了研究。首先对转化的坎利酮衍生产物进行了结构鉴定,以确定衍生产物为11α-羟基坎利酮;然后在10L发酵罐上对根霉转化坎利酮的工艺条件进行了研究;并且对根霉菌体对坎利酮的作用机制进行了初步探索。主要结果如下:   1.首先用乙酸乙酯对根霉转化后的坎利酮衍生产物进行提取,然后通过重结晶法和中压硅胶柱层析法对其进行了纯化,得到纯度为99.5%的坎利酮衍生产物。   2.采用紫外光谱检测坎利酮及其衍生产物,测得其最大吸收波长分别为272nm和271nm;然后对坎利酮及衍生物进行红外光谱检测,红外光谱谱图中衍生产物较坎利酮多出3431.78cm-1的吸收峰,说明衍生产物分子中有羟基存在;再通过高效液相色谱检测坎利酮和衍生产物,二者的保留时间分别为9.216min和6.604min;通过高效液相色谱-质谱联用,测定出底物的分子量340.4,产物的分子量为356.4,衍生产物比坎利酮分子量大16;最后通过核磁共振图谱13C谱确定衍生产物羟基化的位置是在C11位,核磁共振图谱1H谱进一步确定羟基在11-α位。说明坎利酮经过根霉转化后的衍生产物即为11α-羟基坎利酮。   3.对根霉转化坎利酮进行了10L发酵罐放大工艺研究。首先对接种量进行单因子条件优化,结果表明在4%的接种量时转化率最高。然后在4%接种量条件下,通过L16(44)的正交试验,对根霉中试转化条件进行了优化,得到其最优条件为:pH7.0、温度34℃、转速100r/min、通气量0.6v/v/m;从极差可以看出,四个因素中通气量对转化率的影响最大,其次为搅拌转速,而pH值对转化影响最小;在最优条件下,转化率可达到93.6%。   4.对根霉转化坎利酮的机制进行了初步研究。通过菌体对底物的吸附转化实验,结果表明:活菌体对坎利酮同时具有吸附和转化作用;灭活菌体对底物只有吸附作用;活菌体吸附速度比死菌体快;转化坎利酮的酶位于菌丝体内,没有分泌到发酵液中。进一步利用菌体对坎利酮进行半连续转化,发现在四次转化中滤液中的产物比例均较高、杂质少,表明菌体在坎利酮转化中可以重复利用。
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