论文部分内容阅读
背景: 肝糖原累积病Ⅰb型(Glycogen storage disease typeⅠb,GSDⅠb,OMIM:232220)是糖原累积病常见类型之一,占肝糖原累积病Ⅰ型(Glycogen storage disease typeⅠ,GSDⅠ)的20%,是一种由SLC37A4(OMIM:602671)基因突变导致葡萄糖-6-磷酸转移酶(glucose-6-phosphate translocase,G6PT)缺乏的常染色体隐性遗传病。SLC37A4基因位于11号染色体11q23.3,全长约4.5kb,含9个外显子,编码含429个氨基酸的G6PT蛋白,目前已有107种突变被报道(http://www.hgmd.org)。SLC37A4基因突变既有明显的地域性,又有高度的分散性,各个地区的突变热点不同。由它编码的G6PT蛋白是位于细胞内质网上的跨膜蛋白,G6PT酶负责转运葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phophate,G6P),协助葡萄糖-6-磷酸酶系统(G6Pase)催化G6P转化为葡萄糖和磷酸(Pi),维持血糖稳定。 自科学家成功克隆SLC37A4基因以来,国内外学者对GSDⅠb的研究逐渐从疾病的诊断、治疗扩展至对疾病发生、发展以及致病机制的研究,但目前对于GSDⅠb的致病机制及治疗的研究仍存在许多困境。不同于肝糖原累积病Ⅰa型(Glycogen storage disease typeⅠa,GSDⅠa,OMIM:232220)的患儿,通常只有空腹低血糖、肝脏增大、高脂血症、高乳酸血症及高尿酸血症等糖原代谢紊乱症状,给予饮食控制,定期监测,口服生粟米粉(uncooked comstarch,UCCS)后预后良好。GSDⅠb型的患儿除了具有糖原代谢紊乱的临床表现外,还由于中性粒细胞减少及白细胞功能障碍,患儿易反复感染,出现口腔和肠道黏膜溃疡、炎症性肠病等,从而导致预后不良。目前GSDⅠb型患儿中性粒细胞减少及白细胞功能障碍的致病机制尚未明确,为此针对此类患儿进行精准治疗,靶向治疗及预测预后仍难以实现。 随着分子生物学研究的快速发展,临床和基因诊断GSDⅠb已应用的越来越广泛,越来越多的基因突变被发现,如何鉴定这些基因突变的功能,是否具有致病性已成为当前的关键。只有确定了突变基因的致病性,才能帮助已有先证者的家庭进行遗传咨询与产前诊断。 自2011年开始,本课题中心从临床诊断和基因分析等方面对GSDⅠ型患者进行了系列研究。根据临床表现、生化检查及胰高血糖素刺激试验结果,临床诊断出109例肝糖原累积病(LGSDs)患儿。提取外周血基因组DNA,采用PCR直接测序法对SLC37A4基因9个外显子及两侧侧翼序列进行突变分析,检出突变后对先证者父母亲DNA进行相关位点分析,发现GSDⅠb患儿15例。其中发现2个新突变:c.959-960insT及c.454G>C(p.G152R)。新突变采用50名无血缘关系健康儿童的100个等位基因作为正常对照,排除基因多态性。另外,目前国内报道的c.68T>G(p.L23R)、c.343G>A(p.G115R)、c.842G>T(p.G281V)致病性均不能确定。 本研究对该5种c.959-960insT、c.454G>C(p.G152R)、c.68T>G(p.L23R)、c.343G>A(p.G115R)、c.842G>T(p.G281V)突变,分别构建突变体和野生型SLC37A4与EGFP融合基因表达质粒为基础,并体外转染COS-1细胞,直接观察融合蛋白绿色荧光,通过Western blot检测验证蛋白表达。 目的: 本研究采用生物信息学及SLC37A4基因体外瞬时表达体系,对SLC37A4基因新突变进行致病性鉴定及体外功能学鉴定,探讨其致病的可能机理。 方法: 1.5种新突变c.959-960insT、c.454G>C(p.G152R)、c.68T>G(p.L23R)、c.343G>A(p.G115R)、c.842G>T(p.G281V)均采用50名无血缘关系健康儿童的100个等位基因作为正常对照,排除基因多态性。本研究对新突变进行了12个不同物种突变点氨基酸保守性分析; 2.使用SIFT、Polyphen-2软件在线分析进行5种新突变致病性预测; 3.使用SWISS-MODEL在线软件预测目的蛋白的三维结构; 4.本研究以表达增强型绿色荧光蛋白质的质粒pEZ-EGFP为空载体,构建pEZ-SLC37A4-EGFP野生型载体,体外定点诱变成新突变位点相应的突变型载体,并同时构建了一个已知致病突变c.446G>A(p.G149E)载体及多态位点c.405C>T(p.G135=)载体,转染COS-1细胞,建立SLC37A4基因体外真核表达体系,并进行Western印迹分析蛋白的表达,对5个新突变的致病性进行鉴定。 结果: 1.新突变在G6PT蛋白氨基酸一级结构中的位置:本研究中的5种新突变,100个等位基因未发现相同突变,其在G6PT蛋白氨基酸一级结构中具体分布如下:L23R位于1号外显子,G115R位于2号外显子,G152R位于3号外显子,G281V位于6号外显子,以及959-960insT插入突变位于8号外显子。5种新突变的12个不同物种突变点氨基酸保守性分析提示均高度保守或半保守; 2.在线软件致病性预测结果:对其中4种新的错义突变分别进行了SIFT及Polyphen-2软件预测分析,结果显示4种突变的SIFT评分均接近0,Polyphen-2评分均接近1; 3.突变蛋白三维结构预测结果:对人类G6PT蛋白进行生物信息学分析,通过在线软件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)预测其蛋白三维结构。同源模建得出的人类G6PT分子结构是由12个螺旋组成的跨膜蛋白。本研究发现的5种突变包括4个点突变和1个缺失突变:点突变分别位于α1螺旋(p.L23R)、α4螺旋(p.G115R)、α5螺旋(p.G152R)和α8螺旋(p.G281V);缺失突变使C末端自第325位氨基酸残基之后的的326-429号残基全部缺失,蛋白丢失了α10、α11、α12三个螺旋; 4.突变载体真核表达及Western blot检测结果:构建pEZ-SLC37A4-EGFP真核表达质粒经测序分析鉴定,体外定点诱变构建(p.L23R,p.G115R,p.G135=,p.G149E,p.G152R,p.G281V,c.959-960insT)7种突变型质粒。空载体、野生型及突变型(除外c.959-960insT插入突变,本研究中的pEZ-SLC37A4-EGFP质粒,SLC37A4-EGFP为融合基因,c.959-960insT基因突变造成SLC37A4基因终止密码子提前出现,使其后的EGFP蛋白不能表达,从而无绿色荧光出现))载体转染COS-1细胞72h后,荧光显微镜下观察各组细胞均见明亮绿色荧光。Western blot检测SLC37A4野生型和突变型与EGFP融合蛋白在COS-1细胞中的表达,结果提示,空载体、野生型及7种突变型载体转染的COS-1细胞内参GAPDH表达一致,野生型及多态型载体转染的COS-1细胞见目的条带,已知致病突变、5种新突变及空载体均未见目的条带,未检测出G6PT蛋白表达。 结论: 1.通过SLC37A4基因突变分析,我们确诊了15例GSDⅠb型患儿,发现两个新突变:c.959-960insT及c.454G>C(p.G152R),丰富了国内SLC37A4基因突变谱;排除了5种新突变的多态性,氨基酸保守性分析提示均为高度保守或半保守,提示当上述位点突变时,可能影响G6PT酶蛋白的正常结构和生物学功能,从而导致下游产物的生成障碍而致病,出现相应的临床症状; 2.在线软件SIFT及Polyphen-2的新突变致病性预测结果提示新突变致病可能性大; 3.SWISS-MODEL软件在线模拟了突变蛋白三维结构,从结构上看,5个突变位点均位于蛋白的重要跨膜区域,有可能对结构的稳定性产生显著影响,进一步论证了突变的致病可能性,为SLC37A4基因新突变生物信息学分析积累了经验; 4.首次在国内采用瞬时转染的方法进行了SLC37A4基因突变的功能研究。本研究构建了7种SLC37A4基因突变载体,经COS-1细胞瞬时表达研究发现野生型及多态型蛋白可以得到表达,突变型蛋白不能正常表达。