积雪草酸对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞生长、迁移作用及机制研究

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目的通过积雪草酸(Asiatic acid,AA)对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis Fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)增殖、凋亡、迁移等作用的影响,探讨其潜在治疗类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)的作用。方法1、通过MTT法检测不同浓度AA处理的RA-FLS增殖抑制率。2、用集落形成实验检测不同浓度AA对RA-FLS克隆形成的影响。3、利用Hoechst 33342染色法初步观察AA对RA-FLS凋亡情况影响以及形态变化,而后进一步用流式细胞术检测具体细胞凋亡率。4、通过细胞划痕实验对不同浓度AA处理的RA-FLS细胞进行检测观察其迁移变化的情况。5、通过Western blot法检测AA对RA-FLS细胞中细胞凋亡相关蛋白p53、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2;细胞迁移相关蛋白MMP2、MMP9,以及核转录因子-κB(NF-κB),核转录因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)表达情况的影响。结果1、与对照组相比,不同浓度AA(20、40、60、80、100μmol·L-1)处理组RA-FLS的增殖率分别为93.7%(P<0.05)、85.6%(P<0.01)、73.9%(P<0.01)、25.1%(P<0.01)、9.9%(P<0.01),其12h的IC50值为69.27μmol·L-1。2、与对照组相比,AA处理组(20、40、60μmol·L-1)RA-FLS克隆形成率分别为86.9%(P<0.05)、74.8%(P<0.01)、65.4%(P<0.01),AA浓度为80、100μmol·L-1时无细胞克隆形成(P<0.01)。3、RA-FLS经过不同浓度AA处理12h后,凋亡率与对照组相比均升高分别为6.8%(P<0.05)、16.7%(P<0.01)、22.3%(P<0.01)、55.2%(P<0.01)、95.0%(P<0.01);Hoechst 33342染色结果显示与对照组相比凋亡细胞数增多且具有剂量依赖性。4、与对照组相比,AA处理组RA-FLS细胞相对迁移率分别为28.4%(P<0.01)、21.7%(P<0.01)、17.4%(P<0.01)、15.8%(P<0.01)、1.0%(P<0.01)。5、Western blot结果显示:随着药物浓度的升高RA-FLS高表达凋亡相关蛋白Bax、cleaved capase-3和p53,Bcl-2表达下调;同时随着药物浓度的升高迁移相关蛋白MMP2、MMP9表达降低,Nrf2/HO-1表达量升高,NF-κB表达量降低(P<0.05)。结论AA可以诱导RA-FLS凋亡,抑制RA-FLS增殖迁移,以上作用均与AA浓度存在相关性,其促进RA-FLS凋亡机制可能基于p53相关通路,其抑制细胞迁移可能与Nrf2/HO-1对NF-κB的调控有关。
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