宫颈癌(cervical cancer)是发生在宫颈鳞状上皮细胞和宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤,发病率占女性恶性肿瘤第二位,患病率居女性恶性肿瘤第一位,是最常见的妇科恶性肿瘤。大量流行病资料和相关研究显示宫颈癌发病不仅与HPV病毒感染、分娩损伤、致癌物质刺激、性生活紊乱和地理环境等多种因素有关,而且宫颈癌的发生、发展还与肿瘤免疫功能密切相关。因此,对宫颈癌免疫功能的研究有重要意义。调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是一群具有抑制性作用的负调控细胞,根据其不同的细胞表面标志物,可以将Treg细胞分为CD4+Treg细胞、CD8+Treg细胞、NKT Treg细胞和双阴性Treg细胞,其中对CD4+Treg细胞的研究一直是免疫学研究的热点。研究发现Treg细胞在维持机体自身免疫稳定、预防自身免疫性疾病以及器官移植排斥反应等方面发挥了非常重要的保护作用,但是肿瘤患者体内的Treg细胞却能减弱机体的抗肿瘤免疫反应,降低肿瘤免疫治疗效果,所以有学者形象地将Treg细胞比喻为肿瘤逃避免疫系统监视的“隐形衣”。CD25和Foxp3虽然都是CD4+Treg细胞的分子标志物,但效应性T细胞也表达CD25,且体外研究显示只有高表达CD25的CD4+Treg细胞才具有免疫调节作用；Foxp3由于特异性表达在Treg细胞内,检测时需要对Treg细胞进行固定和穿孔,不能用来对活的Treg细胞纯化以进行后续的功能性研究；而CD127在CD4+Treg细胞表面特异性低表达,且在肿瘤组织和外周血中Treg上的表达与Foxp3的表达成负相关,检测时不用破坏细胞膜。因此,我们采用CD4+CD25highCD127low作为筛选Treg细胞的标准,既保证了Treg细胞的完整性,又避免了效应性T细胞等非Treg细胞的干扰。虽然研究显示宫颈癌组织周围及其引流淋巴结中发现大量Treg细胞,也有一止匕Treg细胞在胃癌、食管癌和前列腺癌等恶性肿瘤患者外周血中的含量增高的报道,但是国内外对Treg细胞在宫颈癌患者外周血中的水平以及与肿瘤临床分期关系的报道甚少。本研究通过流式细胞术对宫颈癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞进行检测,结合临床常用免疫功能指标CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞的水平,探讨CD4+CD25highCD127lowTreg与宫颈癌发生、发展的关系及其临床意义。1研究对象1.1实验组：郑州大学第三附属医院临床病理活检已确诊的女性宫颈癌患者21名,其中鳞状细胞癌19例、粘液腺癌2例。鳞状细胞癌又分为原位癌3例、浸润癌16例,其中浸润癌分为高分化鳞癌1例、中分化鳞癌10例和低分化鳞癌5例。患者年龄34-65岁,平均(47±9)岁。排除心、脑、肝、肾等疾病,患者近1个月未做过抗肿瘤治疗,近3个月未使用过免疫增强剂。所有病例采用国际妇产科联盟(FIGO,2000)修订(见附表)的临床分期标准分期,分别为Ⅰ期10例、Ⅱ期7例、Ⅲ期4例。1.2健康对照组：随机选择郑州大学第三附属医院体检的健康女性11名,年龄30-68岁,平均(50±11)岁,与实验组年龄比较无统计学意义。2实验方法2.1血液采集：清晨空腹采集外周静脉血2ml,EDTA抗凝充分混匀确认无凝血,20-25℃室温保存,6h内进行免疫荧光染色处理。染色前进行全血白细胞计数,(3-10)×109/L为合适范围,当白细胞数量增多时用磷酸盐缓冲盐水稀释血液至合适范围内。2.2标本制备：低速涡流混匀抗凝全血,各标记试管分别加入100ul抗凝全血；按试剂说明分别加入相应抗体,低速涡流混匀,室温下避光反应20min;再分别加入1ml溶血剂,低速涡流混匀,室温下避光静置10min,300g离心5min,弃上清,试管底部留下大约50ul残留液,低速涡流混匀；再分别加入lml鞘液,300g离心5min,弃上清,试管底部留下大约50ul残留液；低速涡流混匀,最后加入500ul鞘液,立即上机检测。2.3流式细胞仪测定：按照流式细胞仪操作手册要求检测实验组和健康对照组外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞的水平。3统计学处理实验数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析处理。各组数据用x表示,组间数据比较用t检验。关联分析采用线性相关性分析。检验水准取α=0.05。1 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞在宫颈癌患者和健康女性外周血中的检测：宫颈癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T淋巴细胞的比值(10.11±1.60)%,显著高于对照组[(6.96±0.94)%,t=5.974,P<0.05)]。2 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞表达水平与宫颈癌临床分期关系：Ⅱ期+Ⅲ期宫颈癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占总CD4+T细胞的比值(10.80±1.48)%,明显高于原位癌+Ⅰ期患者[(9.34+1.42)%,P<0.05]和对照组[(6.96±0.94)%,P<0.05)]。3 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞在不同组织学类型宫颈癌患者外周血中的检测：宫颈腺癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T淋巴细胞的(10.86±3.90)%,显著高于对照组(P<0.05)；宫颈鳞癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T淋巴细胞的(9.85±1.39)%,显著高于对照组(P<0.05),但两种不同类型宫颈癌相比,CD4+CD25highCD127lowTreg:细胞表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。4 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞在伴有淋巴结转移宫颈癌患者外周血中的检测：宫颈癌无淋巴结转移者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T细胞的(10.17±1.74)%,显著高于对照组(P<0.05)；宫颈癌伴淋巴结转移者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T细胞的(9.82±0.84)%,显著高于对照组(P<0.05),但两组患者相比,CD4+CD25highCD127lowTreg:细胞表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。5 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞在不同进展水平的鳞状细胞癌患者外周血中的检测：鳞状细胞原位癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T细胞的(8.82±0.59)%,显著高于对照组(P<0.05)；鳞状细胞浸润癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T细胞的(10.16±1.38)%,显著高于对照组(P<0.05),但两种不同进展水平的鳞状细胞癌相比,CD4+CD25highCD127lowTreg细胞表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。6 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞在不同分化程度鳞状细胞癌患者外周血中的检测：中分化鳞状细胞癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg占CD4+T细胞的(10.02±1.50)%,显著高于对照组(P<0.05)；低分化鳞状细胞癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞占CD4+T细胞的(10.03±0.97)%,显著高于对照组(P<0.05),但两种不同分化程度的鳞状细胞癌相比,CD4+CD25highCD127lowTreg细胞表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。7 NK细胞在宫颈癌和健康女性外周血中的检测：宫颈癌患者外周血中NK细胞占淋巴细胞的(10.77±5.19)%,显著低于对照组[(14.67±4.54)%,t=2.611,P<0.05)]。8 NK细胞在不同临床分期宫颈癌患者外周血中的检测：Ⅱ期+Ⅲ期患者外周血中NK细胞占淋巴细胞的(10.80±1.48)%,显著低于健康对照组(P<0.05),健康对照组和Ⅱ期+Ⅲ期患者分别与原位癌+Ⅰ期患者(9.34±1.42)%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。9 CD4+T、CD8+T细胞水平以及CD4+T细胞CD8+T细胞比率变化：实验组和对照组CD4+T、CD8+T细胞表达水平以及CD4+T细胞/CD8+T细胞比率相比较,无统计学意义(P>0.05)。10 CD8+T细胞在不同临床分期宫颈癌患者外周血中的检测：健康对照组、原位癌+Ⅰ期患者和Ⅱ期+Ⅲ期患者分别比较,CD8+T细胞在不同临床分期宫颈癌患者外周血中的表达差异无统计学意义(P>0.05)11 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞与NK细胞的关系：宫颈癌患者外周血中NK细胞的表达水平与CD4+CD25highCD127lowTreg细胞的表达水平存在负相关(r=-0.468,P<0.05)。1宫颈癌患者外周血中CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平升高,该群细胞比例的增加可能通过抑制NK细胞来抑制机体的抗肿瘤免疫作用参与宫颈癌的发生发展。2 CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平可能是一个较好的反映宫颈癌患者免疫功能状态的参考指标,对判断宫颈癌临床分期有一定价值。