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目的:参桃软肝方是广州中医药大学第一附属医院院内制剂,是国医大师周岱翰教授多年来的临床经验方,有健脾养肝、软坚消癥之效,大量前期研究证明,参桃软肝方治疗乙肝病毒相关性肝癌患者临床疗效明确。HBx是HBV基因组四个开放阅读框中,与肝癌关系最密切的一个基因。HBx与肝癌的发生密切相关,HBx可通过DNA甲基化途径促进肝癌的发生。本课题观察参桃软肝方治疗乙肝病毒相关性肝癌患者的作用机制,细胞及动物实验观察参桃软肝方的抑瘤功效,探讨参桃软肝方对乙肝病毒相关性肝癌Hbx表达的影响,揭示参桃软肝方治疗肝癌的分子机制,为参桃软肝方临床推广应用提供科学的理论支持。方法:1.临床上,选取病理组织学或细胞学证实的确诊为原发性肝癌;HBsAg阳性6个月以上,HBV-DNA载量>5.0×102IU/mL的患者入组,给予参桃软肝片口服,一次6片,一日3次。分别于服药前及服药后抽血检测HBx启动子区域DNA甲基化水平。2.按标准方法制备参桃软肝方(STR)冻干粉,并将其作用于人肝癌HepG2.2.15细胞模型,CCK8检测细胞生长抑制率,计算STR的IC50。取对数生长期的HepG2.2.15细胞分别标记为溶剂对照组、中药加5-Aza-CdR组、5-Aza-CdR组、中药组。通过Western blot检测STR对HepG2.2.15细胞株中HBx、DNMT1蛋白表达量的影响。荧光定量 PCR 检测 HBx mRNA、DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA。将对数生长期的HepG2.2.15细胞,加入基础培养基、1mg/mL的STR药液的基础培养基培养72小时后。利用BSP检测HBx启动子区域CpG位点甲基化水平。3.腋窝皮下注射HepG2人肝癌细胞悬液以建立BALB/c-nu小鼠肝癌移植瘤模型。按照小鼠体重、性别随机分为模型组、STRGP低剂量组、STRGP中剂量组、STRGP高剂量组,每组8只。灌胃体积按小鼠体质计算,均为0.1ml/10g,给药频次与给药时程:每天1次,连续给药4周。分别于给药前、给药第5天、第10天、第15.天、第20天、第30天测量瘤体大小,计算各组小鼠肿瘤体积。小鼠给药30天处死后,剥离瘤体,称重并测量瘤体。此外,取16只HBV转基因小鼠按雌雄、体重分层,随机分组为对照组、中药组每组8只。对照组每3日以生理盐水灌胃。灌胃体积按小鼠体重计算,均为0.1ml/10g,中药组参桃软肝片采用临床成人用药剂量的等效剂量的4倍(剂量根据本课题组前期实验设定),配置适量生理盐水,37度加热成混悬液,0.1ml/10g灌胃。给药频次与给药时程:每天1次,连续给药4周。其后采用摘眼球取血法收集小鼠血液,采用全自动临床生化分析仪及生化试剂检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)的含量;采用PCR检测HBV-DNA载量。结果:1.临床研究表明,STRGP可促进乙肝病毒相关性肝癌患者HBx DNA启动子区甲基化。患者分别于服药前后抽血检测,由图可见服用STRGP30天后,HBxDNA启动子区CpG位点甲基化水平由0.7%增加至48.5%,STRGP促进了乙肝病毒相关性肝癌患者HBx DNA启动子区甲基化。2.细胞实验表明,参桃软肝方抑制HepG2.2.15细胞的生长呈时间和剂量依赖性。HepG2.2.15细胞经过不同剂量(0.5mg/ml-2.5mg/ml)浓度梯度的STR处理24h、48h及72h后,与对照组比较,随着STR浓度的升高细胞存活力较对照组降低。且在1.Omg/ml、1.5mg/ml、2.Omg/ml、2.5mg/ml 处,随着 STR 处理时间的延长,HepG2.2.15细胞存活力呈降低的趋势。STR抑制肝癌HepG2.2.15细胞生长,且该抑制呈时间依赖性和剂量依赖性,同一时间点各浓度STR之间有显著性差异(P<0.001),同一浓度STR在各时间点有显著性差异(P<0.001)。HepG2.2.15细胞72h半数抑制率IC50(Half Maximal Inhibition Concentration)数值为:0.6389 mg/ml。结果表明,STR 可抑制HepG2.2.15细胞的增殖,呈时间和剂量依赖关系。Western blot检测表明HepG2.2.15细胞经过STR处理72h后,HBx蛋白表达量降低,STR组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),STR组与STR+5-Aza-C组相比差异有统计学意义(P<0.01),STR组与5-Aza-C组相比差异有统计学意义(P<0.01),即当抑制DNMT1的表达时,STR无法使HBx蛋白表达量降低。说明了 STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达。进一步用荧光定量PCR技术在转录水平检测STR对HBx、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达的影响。结果显示,HepG2.2.15细胞经过STR处理72h后,HBx mRNA表达量降低,STR组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),STR组与STR+5-Aza-C组相比差异有统计学意义(P<0.001),即当抑制DNMT1的表达时,STR无法降低HBx mRNA表达量。这进步一说明可STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx mRNA的水平。HepG2.2.15细胞经过STR处理72h后与对照组比较,DNMT1 mRNA、DNMT3A mRNA、DNMT3B mRNA的表达量均有升高,但STR组与Con组DNMT1 mRNA相比较无显著性差异P=0.1244(P>0.05);STR 组与 Con 组 DNMT3A mRNA 相比较无显著性差异 P=0.264(P>0.05;STR组与Con组DNMT3BmRNA相比较无显著性差异P=0.3449(P>0.05)。本研究通过观察STR作用HepG2.2.15后HBx表达变化,发现STR可以在蛋白质及RNA水平抑制HepG2.2.15细胞中HBx的表达。进一步加入5-Aza-C后,发现在蛋白质及RNA水平,STR均无法抑制HBx的表达,说明在HepG2.2.15细胞中,STR通过DNA甲基化来抑制HBx的表达。BSP实验表明参桃软肝方可促进HepG2.2.15细胞HBx的甲基化,可以看到STR 1mg/mL作用72小时后HBx启动子区由原来的非甲基化变为低甲基化,HBx DNA启动子区CpG位点甲基化水平由0%增加至68.1%。3.动物实验,STRGP作用于BALB/c-nu小鼠肝癌移植瘤模型后,接种HepG2细胞一周后,裸鼠腋下皮肤肉眼可见移植瘤体,分组给药前保持瘤体在同一基线水平,然后分组给药统计分析得出,在给药前各组瘤体大小无差别,给药后第10天,与模型组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积偏小,两组统计学有显著性差异(P<0.05)。给药后第15天、第20天、第30天,与模型组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P<0.001)。该统计结果说明STRGP高剂量可抑制裸鼠HepG2移植瘤体积的增长并且该抑制作用会伴随给药时间的增加而增强。给药后第15天、第20天、第30天,与STRGP低剂量组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P<0.001)。给药后第15天,与STRGP中剂量组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P<0.01)。给药后第20天、第30天,与STRGP中剂量组相比较,STRGP高剂量组移植瘤体积显著偏小,两组比较有显著性差异(P<0.001)。STRGP低剂量和高剂量组与模型组比较,瘤体重量都有下降。STRGP有抑制肿瘤重量的作用,F=19.56,P=0.0126(P<0.05),两两比较中,STRGP高剂量与模型组比较,瘤体重量有显著性差异(P<0.01);STRGP高剂量与STRGP低剂量组比较,瘤体重量有显著性差异(P<0.01);STRGP高剂量与STRGP中剂量组比较,瘤体重量有显著性差异(P<0.01)。STRGP高剂量组可以抑制移植瘤体积以及瘤体重量的增长。STRGP作用于HBV转基因小鼠,给药前取血清检测16只转基因小鼠HBV-DNA载量,两组小鼠实验前HBV-DNA载量在同一基线水平,二者无统计学差异P=0.4805(P>0.05)。比较给药后STRGP组与对照组HBV-DNA载量,发现STRGF组HBV-DNA定量均数较对照组低,但二者无统计学差异P=0.6453(P>0.05)。STRGF对HBV转基因小鼠肝功能的影响的统计结果:STRGF较对照组比较,可降低HBV转基因小鼠AST数值,两组比较的差异有统计学差异P=0.001。STRGF较对照组比较,可降低HBV转基因小鼠ALT数值,两组比较的差异有统计学差异P=0.0087,(P<0.001)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组ALP数值无显著差异,P=0.5347(P>0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组ALB数值无显著差异,P= 0.3777(P>0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组PA数值无显著差异,P=0.1558(P>0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组D-BIL数值无显著差异,P=0.2634(P>0.05)。STRGF组与对照组转基因小鼠相比,STRGF组T-BIL数值无显著差异,P=0.6403(P>0.05)。结论:1.STR治疗肝癌疗效明确,本实验临床研究表明STR可以促进HBV相关性肝癌患者HBx DNA启动子区域CpG位点的甲基化,而HBx被认为是HBV基因组编码的蛋白中与肝癌关系最密切的蛋白之一,HBx可以通过各种途径导致肝癌的发生发展,启动子区域的高甲基化可抑制HBx蛋白的表达,从而达到抑制肝癌生长的目的。本研究清晰揭示了临床中STR治疗肝癌的分子机制,促进了 STR的临床推广应用。2.STR能抑制稳转HBV基因组的人肝癌细胞株的生长,且抑制作用呈时间和剂量依赖性。3.STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达。4.STR通过DNA甲基化抑制HepG2.2.15细胞中HBx mRNA的表达。5.STR能抑制裸鼠HepG2肝癌移植瘤的体积及重量的增长,且抑制作用随着给药时间的延长而增加。6.STR能改善HBV转基因小鼠肝功能的损伤,降低HBV转基因小鼠的AST、ALT指标。