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目的检测人乳腺癌细胞中Rab27A的定位、表达情况，研究Rab27A表达对乳腺癌细胞生物学特性的影响并探讨其作用机制。方法第一部分1、采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术，检测Rab27A及相关的Rab家族成员mRNA在四种人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435和MDA-MB-435HM中的表达。2、通过SYBR greenⅠ法实时半定量逆转录聚合酶链反应（semi-quantitativerealtime RT-PCR）和Western blot方法对Rab27A mRNA及蛋白在人乳腺癌细胞中的差异性表达进行半定量。3、应用免疫荧光（immunofluorescence）及激光共聚焦（confocal）扫描成像技术显示Rab27A蛋白在乳腺癌细胞中的定位及与细胞骨架的关系。4、通过RT-PCR扩增人Rab27A基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）并克隆进真核表达载体pcDNA3.1（+），通过限制性内切酶（EcoRⅠ和HindⅢ）酶切及DNA序列分析进行鉴定。5、应用脂质体转染方法将重组载体pcDNA3.1（+）-Rab27A和pcDNA3.1（+）空载体分别导入人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-435中，G418对转染细胞进行4周筛选并通过RT-PCR和Western blot对细胞克隆Rab27A表达情况进行鉴定。6、WST（water-soluble tetrazolium salt）法测定Rab27A过表达对人乳腺癌细胞体外增殖的影响，并绘制细胞增殖曲线。7、标准PI染色流式细胞计数法（flow cytometry，FCM）检测Rab27A过表达对人乳腺癌细胞细胞周期分布的影响。8、ANNEXIN V-FITC和PI染色流式细胞计数法检测Rab27A过表达对人乳腺癌细胞凋亡的影响。10、细胞体外侵袭实验检测Rab27A过表达对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响。11、裸鼠乳房脂肪垫（mammary fat pad，MFP）接种人乳腺癌细胞，探讨Rab27A过表达对裸鼠原位肿瘤生长及肺转移的影响。第二部分1、应用SYBR greenⅠ实时半定量RT-PCR及Western blot检测Rab27A过表达对人乳腺癌细胞中侵袭转移相关基因表达的影响。2、应用SYBR greenⅠ实时半定量RT-PCR及Western blot检测Rab27A对裸鼠原位移植瘤及肺转移灶中侵袭转移相关基因表达的影响。3、RT-PCR方法检测胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、胰岛素样生长因子受体（IGF receptor，IGFR）及胰岛素受体（insulin receptor，IR）在人乳腺细胞中的表达，并探讨与Rab27A表达之间可能的关系。4、分别用SYBR greenⅠ实时半定量RT-PCR和Western blot检测在条件培养基中培养的乳腺癌细胞内胰岛素样生长因子2（IGF-Ⅱ）mRNA和蛋白水平表达，用酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测条件培养基中IGF-Ⅱ蛋白水平，并探讨这些结果与Rab27A表达水平的关系。5、设计并合成针对人Rab27A基因的RNA干扰片段，将片段重组入载体pcDNATM6.2-GW／EmGFP-miR-lacZ（Invitrogen）中并转染入高表达Rab27A的乳腺癌细胞克隆，实时半定量RT-PCR及Western blot法验证片段下调Rab27A表达的有效性。检测下调Rab27A表达对乳腺癌细胞体外侵袭及上述侵袭转移相关基因表达的影响，同时检测其对IGF-Ⅱ表达和分泌的影响。6、通过Western blot检测IGF-IR信号通路阻断剂NVP-ADW742有效抑制通路下游主要分子总Akt和磷酸化Akt。然后检测对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响及侵袭转移相关基因表达的影响。7、用RT-PCR法检测人乳腺癌细胞中Rab27A结合蛋白的表达，并通过Westernblot来进行蛋白水平表达的检测。8、通过免疫共沉淀（immunocoprecipitation）方法确定结合蛋白与Rab27A蛋白在乳腺癌细胞中的结合状态。结果第一部分1、所检测的Rab家族成员中，只有Rab27A mRNA在人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435及MDA-MB-435HM中的表达水平随细胞侵袭转移能力的增强而升高，而Rab3A、Rab7、Rab33A和Rab37的表达在各细胞株之间未见明显差异。2、Rab27A mRNA在人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-435及MDA-MB-435HM中的表达水平分别是MCF-7中的2.1、3.4和6.9倍（P＜0.05或P＜0.01），而Rab27A蛋白表达分别是MCF-7中的2.83、4.9和9.19倍（P＜0.05或P＜0.01）。3、在人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-435中，Rab27A弥散性分布于细胞浆中，而在后两者中又可见Rab27A蛋白在核周凝聚。4、重组pcDNA3.1（+）-Rab27A质粒经限制性内切酶（EcoRⅠ和HindⅢ）酶切及DNA序列分析证明其序列的正确性。5、脂质体稳定转染后，从MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞中均筛选出两个Rab27A高表达细胞克隆，Rab27A mRNA表达水平分别是亲代细胞的4和4.29及4.43和4.8倍（P＜0.01），而转染空载体的细胞分别是亲代细胞的1.07和1.05倍（P＞0.05）；Rab27A高表达克隆中Rab27A蛋白的表达也分别达到亲代细胞的4.24和4.44倍及4.74和4.90倍（P＜0.01），而转染空载体细胞中的表达分别是亲代细胞的1.03和1.04倍（P＞0.05）。6、Rab27A过表达明显加快乳腺癌细胞体外增殖，培养7天后细胞数约达到对照组的1.6倍（P＜0.01）。7、上调Rab27A表达后S期细胞比例明显增多，由原来的40％上升到70％（P＜0.01），而相应的G0和G1期细胞比例由50％下降到20％（P＜0.01）。8、转染Rab27A后凋亡细胞比例明显减少，在MDA-MB-231细胞中由原来的13％下降到3％（P＜0.01），而在MDA-MB-435细胞中由原来的9％下降到3-4％（P＜0.01）。9、Rab27A高表达细胞克隆体外侵袭能力明显增强，侵袭细胞数在24h和48h时都能达到原来的2.5倍（P＜0.01），而在12h时侵袭细胞数无明显变化（P＞0.05）。10、裸鼠原位移植肿瘤在Rab27A表达上调后生长明显加快，实验结束时（MDA-MB-231，4w；MDA-MB-435，8w）肿瘤平均体积达到对照组的两倍（P＜0.01），并伴有明显的出血坏死。11、Rab27A高表达细胞克隆组裸鼠肺转移率增高，MDA-MB-231组由10％增加到50％（P＜0.01），MDA-MB-435组由60％增加到90％（P＜0.05），平均每个肺内的转移灶数目亦明显增多，在MDA-MB-231组和MDA-MB-435组分别达到对照组的5倍和2.5倍（P＜0.01），肺转移灶体积增大，且可见多个转移灶融合现象。第二部分1、Rab27A在体外正向调节乳腺癌细胞中VEGF、Cathepsin D、Cyclin D1、uPA和MMP-9的表达，而负向调节p16的表达。2、Rab27A在裸鼠体内对上述侵袭转移相关基因的调控与体外结果相似。3、IGF-Ⅱ、Ⅰ型和Ⅱ型IGF受体、胰岛素受体mRNA均表达于四种人乳腺癌细胞，但IGF-ⅠmRNA未见表达。4、Rab27A促进乳腺癌细胞中IGF-Ⅱ分泌，同时减少细胞内的IGF-Ⅱ蛋白含量，但并不影响细胞内的IGF-ⅡmRNA水平。说明Rab27A参与IGF-Ⅱ的分泌而并不影响其表达。5、通过IGF-IR抑制剂阻断IGF-Ⅱ—IGF-IR信号通路后，乳腺癌细胞体外侵袭能力下降（P＜0.05或P＜0.01），同时Rab27A对上述侵袭转移基因表达的调控作用也消失。6、四种乳腺癌细胞均表达两种Rab27A结合蛋白melanophilin和SYTL4。7、在四种乳腺癌细胞中，Rab27A均与SYTL4结合，但只在MCF-7和MDA-MB-231中与melanophilin结合而发挥作用。结论1、Rab27A的表达水平随乳腺癌细胞侵袭转移能力的增强而升高，说明Rab27A表达可能与乳腺癌细胞侵袭转移能力有关。2、Rab27A在体外调节乳腺癌细胞增殖、细胞周期分布、凋亡及细胞侵袭能力，在体内影响裸鼠原位移植瘤生长和肺转移灶的形成，说明其可广泛影响乳腺癌细胞的体内外生物学特性。3、Rab27A蛋白在乳腺癌细胞中促进IGF-Ⅱ的分泌，后者参与调节VEGF、Cathepsin D、Cyelin D1、uPA、MMP-9和p16的表达，并进一步影响乳腺癌细胞体内外生物学特性。4、Rab27A在乳腺癌细胞内通过与SYTL4和／或melanophilin结合而发挥作用。